Mutagénèse dirigée du site actif de la protéinase adénovirale humaine de type 2 : expression et analyse de l'activité de trois mutants

Trois mutants de la protéinase d'Ad2 ont été créés par mutagénèse dirigée. Les mutations effectuées tiennent compte du sous-groupe respectif de chaque acide aminé: l'histidine 54 a été remplacée par une arginine (H54R), l'aspartate 102 par une glutamate (D102E) et la sérine 160 pour une glycine (S160G). Dans le but de vérifier leur activité suite à la mutagénèse, les mutants ont été introduits dans un nouveau vecteur d'expression. La mise au point d'un vecteur permettant la production d'une protéine le plus près possible de la protéinase d'Ad2 était nécessaire si la caractérisation de cette enzyme voulait être poussée plus avant. Le vecteur pRIT2T, déjà utilisé pour produire une protéine fusion entre la protéine A de Staphvlococcus aureus et la protéinase d'Ad2 (Houde et Weber, 1990), a été modifié par une délétion du gène de la protéine A pour donner naissance au vecteur "tronqué" pLAM. Ce nouveau vecteur produit jusqu'à 3,25 fois plus de protéines et ce en deux fois moins de temps. Un système combinant les deux vecteurs permet d'envisager la purification de la plupart des protéines et la production rapide d'anticorps dirigés contre celles-ci. Donc des trois mutants de la protéinase exprimés avec le nouveau vecteur, seul H54R est incapable de cliver les protéines précurseures de Ad2tsl. Ces résultats combinés à de nouvelles études (Webster et al., 1989a, Cai et al., 1990a, 1990b) nous amènent à proposer que la protéinase d'Ad2, jusqu'alors classée comme une sérine protéinase de type chymotrypsine (Bhatti et Weber, 1979a), serait une cystéine protéinase de type chymotrypsine, un intermédiaire évolutif entre les cystéines et les sérine protéinases classiques (Bazan et Fletterick, 1988)

Mutagénèse dirigée du site actif de la protéinase adénovirale humaine de type 2 : expression et analyse de l'activité de trois mutants

Trois mutants de la protéinase d'Ad2 ont été créés par mutagénèse dirigée. Les mutations effectuées tiennent compte du sous-groupe respectif de chaque acide aminé: l'histidine 54 a été remplacée par une arginine (H54R), l'aspartate 102 par une glutamate (D102E) et la sérine 160 pour une glycine (S160G). Dans le but de vérifier leur activité suite à la mutagénèse, les mutants ont été introduits dans un nouveau vecteur d'expression. La mise au point d'un vecteur permettant la production d'une protéine le plus près possible de la protéinase d'Ad2 était nécessaire si la caractérisation de cette enzyme voulait être poussée plus avant. Le vecteur pRIT2T, déjà utilisé pour produire une protéine fusion entre la protéine A de Staphvlococcus aureus et la protéinase d'Ad2 (Houde et Weber, 1990), a été modifié par une délétion du gène de la protéine A pour donner naissance au vecteur "tronqué" pLAM. Ce nouveau vecteur produit jusqu'à 3,25 fois plus de protéines et ce en deux fois moins de temps. Un système combinant les deux vecteurs permet d'envisager la purification de la plupart des protéines et la production rapide d'anticorps dirigés contre celles-ci. Donc des trois mutants de la protéinase exprimés avec le nouveau vecteur, seul H54R est incapable de cliver les protéines précurseures de Ad2tsl. Ces résultats combinés à de nouvelles études (Webster et al., 1989a, Cai et al., 1990a, 1990b) nous amènent à proposer que la protéinase d'Ad2, jusqu'alors classée comme une sérine protéinase de type chymotrypsine (Bhatti et Weber, 1979a), serait une cystéine protéinase de type chymotrypsine, un intermédiaire évolutif entre les cystéines et les sérine protéinases classiques (Bazan et Fletterick, 1988)

Down-regulation of CTLA-4 by HIV-1 Nef protein.

HIV-1 Nef protein down-regulates several cell surface receptors through its interference with the cell sorting and trafficking machinery. Here we demonstrate for the first time the ability of Nef to down-regulate cell surface expression of the negative immune modulator CTLA-4. Down-regulation of CTLA-4 required the Nef motifs DD175, EE155 and LL165, all known to be involved in vesicle trafficking. Disruption of the lysosomal functions by pH-neutralizing agents prevented CTLA-4 down-regulation by Nef, demonstrating the implication of the endosomal/lysosomal compartments in this process. Confocal microscopy experiments visualized the co-localization between Nef and CTLA-4 in the early and recycling endosomes but not at the cell surface. Overall, our results provide a novel mechanism by which HIV-1 Nef interferes with the surface expression of the negative regulator of T cell activation CTLA-4. Down-regulation of CTLA-4 may contribute to the mechanisms by which HIV-1 sustains T cell activation, a critical step in viral replication and dissemination

The cytoplasmic tail of CTLA-4 is dispensable for Nef-induced CTLA-4 down-regulation.

<p>a) Accumulation of CTLA-4 on the cell surface after transfection with CTLA-4 Y201AY218G and CTLA-4ΔCT mutants and lower expression after transfection with CTLA-4 LL181AA. Black solid histograms represent the isotype controls. Grey solid histograms represent the expression of CTLA-4 Wt. Black empty histograms represent CTLA-4 mutants. Numbers in inset represent the MFI of CTLA-4 mutant/CTLA-4 Wt. b) Surface expression levels of the different mutants of CTLA-4 with (empty histograms) or without (filled histograms) Nef expression as measured by flow cytometry. The numbers in inset represent the MFI of CTLA-4 under Nef^wt/Nef^neg co-expression. c) MFI of surface CTLA-4 analyzed by FACS under Nef^neg or Nef^wt co-expression (mean of three independent experiments). The <i>p</i> values were calculated comparing values of CTLA-4 MFI under Nef^wt co-transfection relative to Nef^neg co-transfection. d) Western blot analysis showing the total expressions of CTLA-4 Wt and CTLA-4 mutated forms after co-transfection with Nef^neg (−) or Nef^wt (+) in 293T cells. * Refers to the corresponding MW on the SDS gel.</p

Lysosomal function is required for Nef-induced down-regulation of CTLA-4.

<p>a) CTLA-4 surface expression levels on 293T cells co-transfected with Nef^neg (upper panels) or Nef^wt (lower panels) after treatment with increasing concentrations of Concanamycin A. Grey solid histograms represent the unstained controls. Grey empty histograms represent Mock-transfected cells (stained with anti-CTLA-4 antibody) and Solid Black histograms represent CTLA-4 and either Nef^neg (upper panels) or Nef^wt (lower panels) co-transfected cells. b) Percentage of CTLA-4⁺ cells (left panel) and CD4⁺ cells (right panel) from the same experiment at different concentrations of Concanamycin A (0–20 nM). Solid line represents CTLA-4 or CD4 under Nef^neg and dotted line represents CTLA-4 or CD4 under Nef^wt co-transfection. c) Rescue of total CD4 protein levels by Concanamycin A treatment. Total lysates from 293T cells co-transfected with CD4 and Nef^neg or Nef^wt and treated with increasing concentrations of Concanamycin A (1–20 nM). Numbers on top of CD4 blot represent arbitrary densitometric units after normalization to the <i>β</i>-actin. d) Western blot analysis for total lysates from 293T cells co-transfected with CTLA-4 and either Nef^neg or Nef^wt vectors and treated with increasing concentrations of NH₄Cl (0–20 mM) (n = 2). Numbers on the CTLA-4 Western blot represent arbitrary units for CTLA-4 protein expression levels after normalization to <i>β</i>-actin. e) FACS analysis on 293T cells showing CTLA-4 surface levels under Nef^neg (upper panels) and Nef^wt (lower panels) co-expression in the presence or absence of NH₄Cl. * Refers to the corresponding MW on the SDS gel.</p

Nef and CTLA-4 co-localize in early and recycling endosomes.

<p>a) HeLa cells transfected only with a FLAG-Nef expression vector (upper panels) or co-transfected (lower panels) with CTLA-4 expressing vector were incubated with Alexa 633 labeled transferrin (blue), CTLA-4 specific antibody (green) and FLAG-Nef antibody (red). The extreme left panels show a transmission light field. The middle lower panel shows the co-localization between Nef and CTLA-4 (yellow color results from merging green (CTLA-4) and red (Nef)). The extreme right lower panel shows the co-localization of the three proteins; CTLA-4, Nef and transferrin together (the white color is a combination of green (CTLA-4), red (Nef) and blue (transferrin)), Bar = 20 µm. b) Scatter diagram showing the intensity of the CTLA-4-Alexa-fluor 488 (Y-axis) and Nef-Alexa-fluor 546 (X-axis). c) Levels of co-localization between CTLA-4 and Nef is represented by the mean <i>Pearson's</i> correlation coefficient (R<i>r</i>) (n = 16, 9 fields).</p

CTLA-4 down-regulation by Nef requires motifs in Nef involved in the interaction with the vacuolar ATPase, <i>β</i>-COP and the AP-1 sorting complexes.

<p>a) Total expression levels of CTLA-4 in 293T cells after co-transfection with Nef^wt or Nef mutants by Western blot. Numbers above the Nef blot represent the Nef densitometric units normalized to the <i>ß-</i>actin and showing similar expression levels for the different Nef constructs. b) Densitometric results, normalized to the <i>ß-</i>actin, are presented as mean percentages of CTLA-4 expression after co-transfection with Nef^wt or Nef mutants and normalization to the negative control (Nef^neg) from 3 independent experiments. The <i>p</i> values are calculated using the percentage of CTLA-4 expression under co-transfection with each of the Nef mutants relative to CTLA-4 expression under Nef^wt co-transfection. * Refers to the corresponding MW on the SDS gel.</p