Mutagénèse dirigée du site actif de la protéinase adénovirale humaine de type 2 : expression et analyse de l'activité de trois mutants

Abstract

Trois mutants de la protéinase d'Ad2 ont été créés par mutagénèse dirigée. Les mutations effectuées tiennent compte du sous-groupe respectif de chaque acide aminé: l'histidine 54 a été remplacée par une arginine (H54R), l'aspartate 102 par une glutamate (D102E) et la sérine 160 pour une glycine (S160G). Dans le but de vérifier leur activité suite à la mutagénèse, les mutants ont été introduits dans un nouveau vecteur d'expression. La mise au point d'un vecteur permettant la production d'une protéine le plus près possible de la protéinase d'Ad2 était nécessaire si la caractérisation de cette enzyme voulait être poussée plus avant. Le vecteur pRIT2T, déjà utilisé pour produire une protéine fusion entre la protéine A de Staphvlococcus aureus et la protéinase d'Ad2 (Houde et Weber, 1990), a été modifié par une délétion du gène de la protéine A pour donner naissance au vecteur "tronqué" pLAM. Ce nouveau vecteur produit jusqu'à 3,25 fois plus de protéines et ce en deux fois moins de temps. Un système combinant les deux vecteurs permet d'envisager la purification de la plupart des protéines et la production rapide d'anticorps dirigés contre celles-ci. Donc des trois mutants de la protéinase exprimés avec le nouveau vecteur, seul H54R est incapable de cliver les protéines précurseures de Ad2tsl. Ces résultats combinés à de nouvelles études (Webster et al., 1989a, Cai et al., 1990a, 1990b) nous amènent à proposer que la protéinase d'Ad2, jusqu'alors classée comme une sérine protéinase de type chymotrypsine (Bhatti et Weber, 1979a), serait une cystéine protéinase de type chymotrypsine, un intermédiaire évolutif entre les cystéines et les sérine protéinases classiques (Bazan et Fletterick, 1988)