Identification of new biomarkers for phenotypical characterization in peripheral neuropathies

Introducción Las neuropatías periféricas hereditarias son aquellas enfermedades que afectan al sistema nervioso periférico y cuya etiología reside en un desorden genético hereditario. La neurodegeneración que presentan este tipo de enfermedades se caracteriza por una pérdida progresiva de la función y/o estructura en las neuronas. En el caso de axonopatias el proceso empieza en los extremos distales de los axones largos seguido de una progresión hacia las partes más proximales. Este tipo de desórdenes plantea dificultades en el diagnóstico clínico debido a la variabilidad de síntomas clínicos y a las diferentes variaciones fenotípicas que se presentan en los pacientes. Especies reactivas del oxígeno (ERO) y especies reactivas del nitrógeno (ERN) son generadas en el metabolismo normal de la célula. Mecanismos enzimáticos y no enzimáticos están presentes también en la célula para mantener estas especies reactivas en equilibrio. Alteraciones en los mecanismos de defensa o en los mecanismos que generan ERO y ERN producen lo que se denomina como estrés oxidativo. Este desbalance, conlleva a un aumento de las especies reactivas dando lugar a daño en el ADN, lípidos y proteínas. La generación de este daño produce ciertas marcas en cada uno de estos tipos de moléculas que pueden ser detectados y utilizados como marcadores de estrés oxidativo. La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT; ORPHA166) es la neuropatía hereditaria más común y recoge a un grupo heterogéneo de desórdenes con características clínicas, neurofisiológicas, genéticas y patológicas comunes. Las características clínicas que definen este tipo de pacientes son: debilidad y deterioro muscular de las extremidades distales, reflejo osteotendinoso disminuido o ausente, pérdida de la sensibilidad distal y frecuentemente deformidades esqueléticas. Este fenotipo y las características clínicas observadas en pacientes con CMT son consecuencia de una progresiva pérdida axonal en los nervios sensitivos y motores. Este desorden tiene un origen genético diverso con más de 75 genes asociados a la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. El desorden genético que con más frecuencia se encuentra en pacientes con la enfermedad de CMT es una duplicación intracromósomica que incluye a la parte del gen codificante para la proteína periférica de mielina de 22 kDa (PMP22). Este tipo de alteración define un subtipo de la enfermedad denominado CMT subtipo 1A (CMT1A). PMP22 es una proteína integral de la membrana altamente expresada por las células de Schwann mielinizantes del sistema nervioso periférico. Esta proteína forma parte de la región compacta de la vaina de mielina donde tiene una función estructural además de participar en los primeros pasos de la formación de ésta. PMP22 además actúa como mediador entre la célula de Schwann y la matriz extracelular, regulando la proliferación celular y la apoptosis, y ha sido relacionada con las uniones intracelulares. La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, como ya se ha descrito, presenta un fenotipo heterogéneo con un amplio rango de alteraciones genéticas y genes implicados. Además, el debut en la infancia, la diferente progresión y severidad de los pacientes de CMT y la falta de tratamiento para esta enfermedad hereditaria potencia la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y monitorización de los efectos terapéuticos de los ensayos clínicos. La ataxia de Friedreich (FRDA; OMIM 229300) es una enfermedad mitocondrial neurodegenerativa con una herencia autosómica recesiva, aunque dentro de las ataxias hereditarias es la más prevalente. A pesar de este último hecho, se considera una enfermedad rara o poco frecuente con un debut en la infancia y que presenta una progresiva pérdida de las neuronas sensitivas en el ganglio dorsal de la raíz y la columna posteriores de la médula. Además de presentar alteraciones en el sistema nervioso periférico, el sistema nervioso central también está afectado detectando alteraciones en el núcleo dentado del cerebelo de estos pacientes. Al mismo tiempo de estas características neurológicas, otras enfermedades concomitantes se han descrito en pacientes de FRDA. Así, los pacientes de FRDA pueden presentar, además de mostrar las características neurológicas, escoliosis, diabetes tipo II y cardiomiopatía hipertrófica. Esta última es la principal causa de muerte en pacientes de FRDA. El fenotipo observado en pacientes de FRDA está causado por una alteración en el número de repeticiones del tripéptido guanina-adenina-adenina (GAA) en el primer intrón del gen que codifica FXN que codifica para la proteína frataxina. Alelos con hasta 36 repeticiones son considerados como normales, mientras que más de estas repeticiones puede conllevar la generación de expansiones patogénicas. En el caso de ataxia de Friedreich las repeticiones fluctúan entre 44 y 1700 y generan la disminución de expresión de la proteína frataxina. La función principal de frataxina no está claramente corroborada, sin embargo, esta proteína se ha visto implicada en diversas funciones. Una de las primeras descritas fue en relación a su capacidad para unir hierro ejerciendo un papel de almacenaje de hierro. Por otro lado, también se la ha relacionado con la formación de los clústers hierro-azufre, imprescindibles para el correcto funcionamiento en la mitocondria de los complejos I, II y III de la cadena de transporte electrónico y la enzima aconitasa, y en la biosíntesis de grupo hemo. Este tipo de ataxia, presenta diferencias en las características clínicas, así como en la progresión de la enfermedad. Además, la presencia de enfermedades concomitantes incrementa la complejidad de esta neuropatía por lo que se está incrementando el estudio de posibles biomarcadores pronóstico de esta enfermedad. No obstante, no existen biomarcadores fiables que puedan estratificar los pacientes según su enfermedad/es concomitante/s (diabetes, escoliosis y cardiomiopatía hipertrófica). Los microARNs (miARN) son pequeñas secuencias de 22 nucleótidos localizadas en regiones intragénicas y/o intrínsecas de transcritos que codifican para proteínas. Tras su procesamiento por el complejo Drosha-DGCR8 y Dicer, dos hebras complementarias se generan y una es incorporada al complejo de silenciamiento inducido de ARN. Este complejo se une por complementariedad a la secuencia de ARN mensajero de la proteína diana controlando su degradación, y por tanto los niveles de proteína. Estas pequeñas moléculas genómicas han sido descritas como biomarcadores de diferentes enfermedades. Están además implicadas en el desarrollo y correcto funcionamiento del sistema nervioso. Por ello estudios de los perfiles de expresión de estos miARN puede proveer de más conocimiento acerca de los mecanismos patológicos de las enfermedades neurodegenerativas además de servir como biomarcadores de progresión de la enfermedad y monitorización de los tratamientos que se utilicen durante los ensayos clínicos. Hipótesis y objetivos Dada la heterogeneidad fenotípica observada tanto en los pacientes de Charcot-Marie-Tooth como en los de ataxia y la ausencia de marcadores de pronóstico y seguimiento de ensayos clínicos fiables, la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores es más que patente. Análisis de marcadores de estrés oxidativo y de expresión de proteínas pueden proporcionar un perfil de expresión diferencial entre pacientes leves, pacientes severos y controles que puede utilizarse como biomarcadores en este tipo de pacientes. Por otra parte, estudios de expresión diferencial de miARN pueden dilucidar diferencias en el perfil de expresión entre pacientes de FRDA o los diferentes modelos celulares de ataxia de Friedreich y sus respectivos controles que pueden ser nuevos biomarcadores para esta neuropatía. El principal objetivo de este estudio es encontrar biomarcadores de estratificación clínica, pronóstico y/o monitorización de ensayos clínicos en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y en la ataxia de Friedreich. Para ello se pretende llevar a cabo los siguientes objetivos y sub-objetivos: I. Búsqueda de biomarcadores en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22. a. Analizar marcadores de estrés oxidativo en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22. b. Explorar la expresión diferencial de marcadores proteómicos en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22 y validar los posibles biomarcadores. II. Búsqueda de biomarcadores genómicos en plasma de pacientes de ataxia de Friedreich y modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y). a. Evaluación de la representación diferencial de los miARN en muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles sanos, análisis bioinfomático de las rutas reguladas por estos miARN y validación de miARN candidatos a biomarcadores y sus rutas diana. b. Analizar la expresión diferencial de modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y), análisis bioinfomático de las rutas reguladas por estos miARN y validación de miARN candidatos a biomarcadores y sus rutas diana c. Validar el perfil de miARN de muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles sanos en modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y) y sus rutas diana. Metodología Tras obtener la aprobación de los comités éticos y científicos de los hospitales y biobancos implicados en este estudio, se realizó la colecta de las muestras de plasma en tubos EDTA de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (Subtipo 1A) y de ataxia de Friedreich y sus respectivos controles agrupados por edad y sexo. Para el caso de CMT, 42 pacientes caucásicos y 22 sujetos caucásicos sanos se unieron a estudio. Los pacientes se clasificaron según la escala CMTNS en leves si el valor era menor o igual a 15 o en severos si el valor era superior a 15. En el caso de FRDA 25 pacientes caucásicos y 25 controles caucásicos fueron incluidos en el estudio. Además de las muestras de plasma tres modelos celulares diferentes de ataxia de Friedreich fueron utilizados en este trabajo: líneas celulares de fibroblastos de pacientes de FRDA y fibroblastos de sujetos sanos; líneas celulares de células madre de la mucosa olfativa de pacientes de FRDA e individuos sanos; línea celular de deficiencia en frataxina por interferencia en células de neuroblastoma SH-SY5Y y sus controles. Para la búsqueda de biomarcadores de estrés oxidativo en muestras de plasma de CMT, se determinaron los niveles de Malondialdehido (MDA) mediante cromatografía liquida de alta presión acoplada a detección con ultravioleta (HPLC-UV). Los niveles de proteínas carboniladas se obtuvieron mediante derivatización de las muestras con el kit “Oxi-BlotTM protein oxidation detection kit” (Millipore, EE. UU.) y posterior inmunodetección con técnica “dot-blot”, en la que las muestras son adsorbidas en una membrana de nitrocelulosa y para posteriormente realizar la inmunodetección con anticuerpos específicos. También mediante esta técnica “dot-blot” se obtuvieron los niveles de proteínas nitrosiladas. Las imágenes obtenidas se densitometraron mediante el uso del software imageJ. Para obtener los niveles de glutatión, así como determinar el ratio de glutatión oxidado (GSSG) y reducido (GSH), se utilizó el kit comercial “DetectX Glutathione kit” (Arbor Assays, EE. UU). Por último, mediante el uso del kit “Cayman’s Antioxidant Assay Kit” (Cayman, EE. UU.) se determinó la capacidad antioxidante total que presentaba cada uno de los grupos analizados. Para realizar el análisis proteómico de las muestras de plasma de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth se realizó mediante el uso de una técnica mejorada de la electroforesis en dos dimensiones: la electroforesis diferencial en gel de dos dimensiones (2D-DIGE). Esta técnica permite identificar las proteínas con expresión diferencial entre un grupo diana (en nuestro caso el grupo leve o severo de pacientes de CMT) y un grupo control. Para ello cada una de las muestras seleccionadas de cada uno de los grupos se tiñe con un fluoróforo de los denominados cyDyes diferente. Este tipo de fluoróforos se unen covalentemente en una proporción uno: uno a la proteína. Además, una mezcla equimolecular de ambas muestras se tiñó con otro fluoróforo Cy diferente a los anteriores para normalizar los niveles de proteínas. Las tres muestras teñidas se incorporaron a una tira de gradiente de pH inmovilizado “IPG strips” (24cm, non-lineal pH 3-10, Immobiline DryStrip, GE Healthcare, EE. UU.) y se separaron según su punto isoeléctrico. Posteriormente estas tiras se incorporaron a geles de poliacrilamida donde se realizó la segunda dimensión de la técnica y las proteínas que previamente se habían separado por punto isoeléctrico, se separaron además por tamaño molecular. Los geles fueron escaneados con “Typhoon™ TRIO” (GE Healthcare, EE. UU) y analizados con el software Decyder software (GE Healthcare, EE. UU.) que nos determinó los picos con expresión diferencial observados en cada uno de los contrastes realizados. Estos picos identificados en el gen posteriormente fueron extraídos utilizando un equipo “Ettan spot picker” (GE Healthcare, EE. UU). Cada una de las muestras obtenidas del análisis 2D-DIGE fueron analizadas por espectrometría de masas o por cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas, identificando así cada una de las muestras que se observaron con expresión diferencial. Para determinar la relevancia de estas proteínas en el contexto de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, se realizó un estudio bioinformático con la herramienta web PhenUMA, en la que se realizó un primer análisis de similitudes fenotípicas que presenta el gen mutado en estos pacientes (PMP22) y posteriormente otro análisis de relaciones fenotípicas entre los genes relacionados con PMP22 por presentar rasgos fenotípicos similares al ser alterados y los genes de las proteínas identificadas en el análisis 2D-DIGE. Por último, se realizó una validación de la proteína gelsolina mediante el uso de ensayos de inmunodetección ligados a enzimas (ELISA), en concreto el kit comercial “Human plasma (soluble) gelsolin ELISA kit” (Aviscera Biocience, EE. UU.). En el caso de los análisis genómicos de miARN, a partir de las muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles o precipitado de las diferentes líneas celulares presentes en los tres modelos de FRDA mencionados anteriormente se aisló la fracción pequeña de ARN. En el caso de las muestras de plasma se realizó mediante el uso del kit “miRNeasy Serum/Plasma kit” (Qiagen, Termofisher, EE. UU.), mientras que en el caso de los modelos celulares se utilizó el kit “miRvana miRNA Isolation Kit” (Applied Biosystems/Ambion, EE. UU.). Una vez aislados los miARN se procedió al análisis de secuenciación de la fracción pequeña de ARN (small-RNA sequencing). Los miARN procedentes de plasma fueron analizados mediante la plataforma Ilumina. Para ello, previamente a la secuenciación se generó una biblioteca de ADN complementario (cADN) utilizando para ello los kits “RNA Library Prep Set for Illumina” (Set 1&2) (New England Biolabs, EE. UU.). Estas bibliotecas fueron empleadas para la generación de los “clústers” y la secuenciación en la plataforma de “Illumina HiScanSQ platform” (50 bp single read; Illumina, EE. UU.). Los resultados obtenidos fueron analizados para determinar su calidad mediante el software FastQC y alineadas con el genoma humano de referencia Hg18 y la base de datos de miARN miRBase v21 utilizando para ellos los paquetes “Subread” y “Rsubread”. Por otro lado, los miARN procedentes de los modelos celulares fueron secuenciados mediante la tecnología “Ion Torrent”. La generación previa de la biblioteca de cADN por tanto se realizó mediante el kit, correspondiente para esta plataforma de secuenciación, “Ion Total RNA-Seq Kit v2” (Life Technologies/Thermo fisher, EE. UU.). Estas bibliotecas de cADN se utilizaron para generar las “beads” que se incorporaron al chip que posteriormente se introduciría en el secuenciador “Ion Proton sequencer” (Life Technologies/Thermo FIsher, EE. UU.). Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el genoma de referencia Hg19 y la base de datos de miARN miRBase v21. La expresión de los miARN procedentes de plasma fueron normalizadas y se seleccionaron aquellos que tenían una expresión diferencial con una tasa de falso descubrimiento (FDR) de 1e-4. En el caso de los miARN de modelos celulares la expresión diferencial de estos fue calculada utilizando los paquetes del software R denominados “EdgeR” y “DESeq” 2. Por último, se determinaron las proteínas diana de regulación de los miARN detectados con expresión diferencial mediante el uso de la sección DIANA-microT-CDS del servidor web DIANA v5.0 y “DIANA-miRPath” v3.0 para determinar las rutas moleculares en las cuales están las dianas de los miARN. Estos miARN fueron validados mediante técnicas de cuantificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR), así como la evaluación de los niveles de ARN mensajero de las dianas del miR-330-3p. Por último, se realizaron análisis estadísticos Chi-cuadrado para determinar si los miARN encontrados con expresión diferencial en plasmas de pacientes de ataxia de Friedreich respecto a sus controles permitían estratificar a los pacientes según su enfermedad concomitante (diabetes o cardiomiopatía). Además, se realizaron análisis de curvas de Característica Operativa del Receptor (ROC) para determinar la especificidad y la sensibilidad de los miARN. Todos estos análisis se realizaron mediante el uso del software SPSS versión 20 (IBM Corporation, EE. UU.). El resto de análisis estadísticos no especificados se realizaron mediante el uso del software “Graphpad Prism” versión 6 (GraphPad Software, EE. UU.). Resultados y discusión Las enfermedades neurodegenerativas presentan una alta variabilidad fenotípica y genotípica, por ello es de especial relevancia la obtención de nuevos biomarcadores que permitan mejorar el conocimiento sobre la estratificación de pacientes, la progresión de la enfermedad y la monitorización de tratamientos analizados en ensayos clínicos. En esta tesis se ha pretendido obtener biomarcadores de estrés oxidativo y proteómicos en plasmas pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en gen de la proteína PMP22 y biomarcadores genómicos, en concreto miARN, en plasmas de pacientes de ataxia de Friedreich y modelos celulares de esta enfermedad. En la búsqueda de biomarcadores de estrés oxidativo en los plasmas de CMT, se analizaron los niveles de daño proteico por estrés oxidativo mediante los niveles de proteínas carboniladas y nitrosiladas. También se determinaron los niveles de daño oxidativo en lípidos mediante los niveles de malondialdehido (MDA). Sin embargo, no se entraron diferencias en ninguno de ellos. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de capacidad antioxidante total, ni en los niveles de glutatión total y cociente GSSG/GSH, por lo que parece que no hay marcadores de estrés oxidativo en plasmas de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en el gen PMP22 (CMT1A). Por otra parte, en el análisis proteómico mediante la técnica 2D-DIGE, se identificaron veinte proteínas con expresión diferencial entre pacientes de CMT (pacientes leves y pacientes severos) comparados con los sujetos sanos. Estas proteínas fueron: Afamina, Región C de la cadena kappa de las inmunoglobulinas, Plasminógeno, Factor B del complemento, gelsolina, Antitrombina-III, Apolipoproteína A-IV, Haptoglobina, Clusterina, Componente C6 del complemento, Cadena del fibrinógeno, Vitronectina, Serotransferrina, Kininogeno-1, Alfa-1-antitrypsina, Alfa-2-HS-glicoproteina, Alfa-1B-glicoproteina, Proteína de unión a vitamina D, Apolipoproteína E y Apolipoproteína A-I. De estas proteínas solo diecisiete mostraron tener relación con PMP22 a través de otras proteínas que al ser mutadas tenía un fenotipo similar al observado en la duplicación de PMP22 al analizarlas con el software PhenUMA. Gelsolina es una de las proteínas identificadas con expresión diferencial entre pacientes leves de CMT y pacientes severos al compararlos con los sujetos sanos. Esta proteína está relacionada con PMP22 a través de otras proteínas relacionadas fenotípicamente con esta última y además ha sido descrita con niveles alterados en otra neuropatía, la amiloidosis familiar tipo finlandesa. Por ello se validaron los niveles de esta proteína en los tres grupos estudiados (pacientes leves, pacientes severos y controles). Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles de gelsolina entre estos grupos. Además, también se analizó la correlación entre la edad de los pacientes de CMT o controles y los niveles de esta proteína, ya que en el caso de la amiloidosis familiar si se observó una relación entre los niveles de esta proteína y la edad. En el caso de los pacientes de CMT, una ligera correlación se observó entre la edad y los niveles de gelsolina, pero no suficiente para que las diferencias en los niveles de gelsolina puedan ser explicados por las diferencias de edad. En el caso de los pacientes no se observó correlación. Todos estos resultados muestran que gelsolina no es un buen biomarcador para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Del resto de proteínas identificadas, la proteína de unión a vitamina D ha sido descrita como biomarcador en otras enfermedades neurodegenerativas. Otras proteínas implicadas en la coagulación como son plasminógeno y la antitrombina III se han descrito como alteradas en dife

miR-1226 detection in GCF as potential biomarker of chronic periodontitis: a pilot study

The study and identification of new biomarkers for periodontal disease, such as microRNAs (miRNAs), may give us more information about the location and severity of the disease and will serve as a basis for treatment planning and disease-monitoring. miRNAs are a group of small RNAs which are involved in gene regulation by binding to their messenger RNA target (mRNA). In this pilot study, the procedure for purifying miRNAs from gingival crevicular fluid (GCF) was, for the first time, described. In addition, the concentration of miRNAs in GCF was analyzed and compared between patients with moderate or severe chronic periodontitis (CP) and healthy controls. GCF samples were collected from single-rooted teeth of patients with moderate or severe CP (n=9) and of healthy individuals (n=9). miRNAs were isolated from GCF using miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen, CA. USA). Reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to determine the expression of a series of miRNAs candidates that are related to bone metabolism. The significance of differences in miRNA levels between both groups was determined using Mann-Whitney U test. The results from this pilot study indicate that miRNAs can be isolated from GCF. Six different miRNAs were analyzed (miR-671, miR-122, miR-1306, miR-27a, miR-223, miR-1226), but only miR-1226 showed statically significant differences between the CP group and healthy controls (p<0.05). This miRNA was downregulated in patients with CP. Within the limitations of the present study, it may be concluded that miR-1226 can be a promising biomarker for periodontal disease, adding relevant information to common clinical parameters used for diagnosis and prognosis of periodontitis

A Drosophila model of GDAP1 function reveals the involvement of insulin signalling in the mitochondria-dependent neuromuscular degeneration

[EN] Charcot-Marie-Tooth disease is a rare peripheral neuropathy for which there is no specific treatment. Some forms of Charcot-Marie-Tooth are due to mutations in the GDAP1 gene. A striking feature of mutations in GDAP1 is that they have a variable clinical manifestation, according to disease onset and progression, histology and mode of inheritance. Studies in cellular and animal models have revealed a role of GDAP1 in mitochondrial morphology and distribution, calcium homeostasis and oxidative stress. To get a better understanding of the disease mechanism we have generated models of over-expression and RNA interference of the Drosophila Gdapl gene. In order to get an overview about the changes that Gdapl mutations cause in our disease model, we have combined a comprehensive determination of the metabolic profile in the flies by nuclear magnetic resonance spectroscopy with gene expression analyses and biophysical tests. Our results revealed that both up- and down-regulation of Gdapl results in an early systemic inactivation of the insulin pathway before the onset of neuromuscular degeneration, followed by an accumulation of carbohydrates and an increase in the (3-oxidation of lipids. Our findings are in line with emerging reports of energy metabolism impairments linked to different types of neural pathologies caused by defective mitochondrial function, which is not surprising given the central role of mitochondria in the control of energy metabolism. The relationship of mitochondrial dynamics with metabolism during neurodegeneration opens new avenues to understand the cause of the disease, and for the discovery of new biomarkers and treatments.This work was supported by a project grant from the Association Francaise contre les Myopathies [AFM 18540 to M.I.G]; a collaborative grant from International Rare Diseases Research consortium (IRDiRC) and Institute de Salud Carlos III [IR11/TREAT-CMT to M.I.G. (partner 12) and F.V.P. (partner 8)]; funding from Institute de Salud Carlos III through Biomedical Network Research Center for Rare Diseases and the INGENIO 2010 program to F.V.P.; and a project grant from the Spanish Government (Secretaria de Estado de Investigacion, Desarollo e Innovacion, Ministerio de Economia y Competitividad) [SAF2014-53977-R to A.P.].Lopez Del Amo, V.; Palomino-Schätzlein, M.; Seco-Cervera, M.; Garcia-Gimenez, JL.; Pallardó-Calatayud, FV.; Pineda-Lucena, A.; Galindo-Orozco, MI. (2017). A Drosophila model of GDAP1 function reveals the involvement of insulin signalling in the mitochondria-dependent neuromuscular degeneration. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863(3):801-809. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2017.01.003S8018091863

Estudio del perfil oxidativo en fibroblastos nih3t3 con la actividad proteasomal inhibida y en fibroblastos de pacientes con la enfermedad de lafora

[ES] Tioredoxina 1 (Trx1) es una disulfito reductasa localizada en el citoplasma y también el núcleo. Trx1 está relacionada con distintos procesos celulares como apoptosis, síntesis de desoxiribunucleótidos, transporte de electrones, actividad antioxidante y regulación de varios factores de transcripción. Proteasoma es responsable de la degradación selectiva de la mayoría de proteínas nucleares y citosólicas marcadas para degradación, además de controlar el ciclo celular, la transcripción y la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) en el retículo endoplásmico. La enfermedad de Lafora es una enfermedad rara (ORPHA501) caracterizada por una epilepsia mioclónica progresiva. Han sido identificados dos genes afectados en pacientes de Lafora: EPM2A que codifica para una fosfatasa denominada laforina y EPM2B que codifica para una E3 ubiquitina-ligasa. Este trabajo se centra por un lado en el estudio en fibroblastos NIH3T3 de la expresión y localización de Trx1 con la proliferación celular y tras la inhibición de la actividad proteasomal con MG132 a dosis infratóxicas. Por otro lado se estudio la expresión y localización de Trx1 en fibroblastos procedentes de pacientes con la Enfermedad de Lafora. Finalmente se estudió la posible interacción de Trx1 y proteasoma en ambas líneas celulares[EN] Thioredoxin 1 (Trx1) is a disulfide reductase localized in the cytoplasm and also in the nucleus. Trx1 has been involved in distinct cellular processes such as apoptosis, synthesis of deoxyribonucleotides, electron transport, antioxidant activity and regulation of many transcription factors. Proteasome is responsible for the selective degradation of the majority of marked for destruction nuclear and cytosolic proteins and it also controls cell-cycle progression, regulates the transcription and the unfolded protein response (UPR) at the endoplasmic reticulum. Lafora¿s disease (LD) is a rare disease (ORPHA501) characterized by progressive myoclonus epilepsy. Two genes have been identified in LD patients: EPM2A encoding a phosphatase called laforin and EPM2B encoding an E3 ubiquitin ligase named malin. In this work we study on one hand the expression and locatization of Trx1 during cell proliferation and after proteasomal inhibition with MG132 at subletal dosis in NIH3T3 fibroblasts. On the other hand we study the expression and localization of Trx1 in fibroblasts from Lafora pacients. Finally we study the interaction of Trx1 and proteasome in both cell lines.Seco Cervera, M. (2012). Estudio del perfil oxidativo en fibroblastos nih3t3 con la actividad proteasomal inhibida y en fibroblastos de pacientes con la enfermedad de lafora. http://hdl.handle.net/10251/27263Archivo delegad

Is the Macrophage Phenotype Determinant for Fibrosis Development?

Fibrosis is a pathophysiological process of wound repair that leads to the deposit of connective tissue in the extracellular matrix. This complication is mainly associated with different pathologies affecting several organs such as lung, liver, heart, kidney, and intestine. In this fibrotic process, macrophages play an important role since they can modulate fibrosis due to their high plasticity, being able to adopt different phenotypes depending on the microenvironment in which they are found. In this review, we will try to discuss whether the macrophage phenotype exerts a pivotal role in the fibrosis development in the most important fibrotic scenarios

Thioredoxin and Glutaredoxin Systems as Potential Targets for the Development of New Treatments in Friedreich’s Ataxia

The thioredoxin family consists of a small group of redox proteins present in all organisms and composed of thioredoxins (TRXs), glutaredoxins (GLRXs) and peroxiredoxins (PRDXs) which are found in the extracellular fluid, the cytoplasm, the mitochondria and in the nucleus with functions that include antioxidation, signaling and transcriptional control, among others. The importance of thioredoxin family proteins in neurodegenerative diseases is gaining relevance because some of these proteins have demonstrated an important role in the central nervous system by mediating neuroprotection against oxidative stress, contributing to mitochondrial function and regulating gene expression. Specifically, in the context of Friedreich’s ataxia (FRDA), thioredoxin family proteins may have a special role in the regulation of Nrf2 expression and function, in Fe-S cluster metabolism, controlling the expression of genes located at the iron-response element (IRE) and probably regulating ferroptosis. Therefore, comprehension of the mechanisms that closely link thioredoxin family proteins with cellular processes affected in FRDA will serve as a cornerstone to design improved therapeutic strategies

Oxidative Stress and Epigenetics: miRNA Involvement in Rare Autoimmune Diseases

Autoimmune diseases (ADs) such as Sjögren’s syndrome, Kawasaki disease, and systemic sclerosis are characterized by chronic inflammation, oxidative stress, and autoantibodies, which cause joint tissue damage, vascular injury, fibrosis, and debilitation. Epigenetics participate in immune cell proliferation and differentiation, which regulates the development and function of the immune system, and ultimately interacts with other tissues. Indeed, overlapping of certain clinical features between ADs indicate that numerous immunologic-related mechanisms may directly participate in the onset and progression of these diseases. Despite the increasing number of studies that have attempted to elucidate the relationship between miRNAs and oxidative stress, autoimmune disorders and oxidative stress, and inflammation and miRNAs, an overall picture of the complex regulation of these three actors in the pathogenesis of ADs has yet to be formed. This review aims to shed light from a critical perspective on the key AD-related mechanisms by explaining the intricate regulatory ROS/miRNA/inflammation axis and the phenotypic features of these rare autoimmune diseases. The inflamma-miRs miR-155 and miR-146, and the redox-sensitive miR miR-223 have relevant roles in the inflammatory response and antioxidant system regulation of these diseases. ADs are characterized by clinical heterogeneity, which impedes early diagnosis and effective personalized treatment. Redox-sensitive miRNAs and inflamma-miRs can help improve personalized medicine in these complex and heterogeneous diseases

Increased oxidative stress and impaired antioxidant response in Lafora disease

15 páginas, 10 figurasLafora disease (LD, OMIM 254780, ORPHA501) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by the presence of glycogen-like intracellular inclusions called Lafora bodies and caused, in the vast majority of cases, by mutations in either EPM2A or EPM2B genes, encoding respectively laforin and malin. In the last years, several reports have revealed molecular details of these two proteins and have identified several processes affected in LD, but the pathophysiology of the disease still remains largely unknown. Since autophagy impairment has been reported as a characteristic treat in both Lafora disease cell and animal models, and as there is a link between autophagy and mitochondrial performance, we sought to determine if mitochondrial function could be altered in those models. Using fibroblasts from LD patients, deficient in laforin or malin, we found mitochondrial alterations, oxidative stress and a deficiency in antioxidant enzymes involved in the detoxification of reactive oxygen species (ROS). Similar results were obtained in brain tissue samples from transgenic mice deficient in either the EPM2A or EPM2B genes. Furthermore, in a proteomic analysis of brain tissue obtained from Epm2b-/- mice, we observed an increase in a modified form of peroxiredoxin-6, an antioxidant enzyme involved in other neurological pathologies, thus corroborating an alteration of the redox condition. These data support that oxidative stress produced by an increase in ROS production and an impairment of the antioxidant enzyme response to this stress play an important role in development of LDThis work was supported by grants from the Spanish Ministry of Education and Science (SAF2011-27442, BFU2011-22630), Fundació La Marató de TV3 (ref. 100130), EU Funded FRAILOMIC-HEALTH.2012.2.1.1, TREAT-CMT IRDiRC consortium Research fellowship, Generalitat Valenciana (Prometeo 2009/051, Prometeo 2012/061) and an ACCI2012 action from CIBERERPeer reviewe

Lafora disease fibroblasts exemplify the molecular interdependence between thioredoxin 1 and the proteasome in mammalian cells

13 páginas, 8 figuras (que no aparecen en este documento, se pueden consultar en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584913003274#ec0005)Thioredoxin 1 (Trx1) is a key regulator of cellular redox balance and participates in cellular signaling events. Recent evidence from yeast indicates that members of the Trx family interact with the 20S proteasome, indicating redox regulation of proteasome activity. However, there is little information about the interrelationship of Trx proteins with the proteasome system in mammalian cells, especially in the nucleus. Here, we have investigated this relationship under various cellular conditions in mammalian cells. We show that Trx1 levels and its subcellular localization (cytosol, endoplasmic reticulum, and nucleus) depend on proteasome activity during the cell cycle in NIH3T3 fibroblasts and under stress conditions, when proteasomes are inhibited. In addition, we also studied in these cells how the main cellular antioxidant systems are stimulated when proteasome activity is inhibited. Finally, we describe a reduction in Trx1 levels in Lafora disease fibroblasts and demonstrate that the nuclear colocalization of Trx1 with 20S proteasomes in laforin-deficient cells is altered compared with control cells. Our results indicate a close relationship between Trx1 and the 20S nuclear proteasome and give a new perspective to the study of diseases or physiopathological conditions in which defects in the proteasome system are associated with oxidative stress.The authors wish to thank to S. Bañuls for their technical support. F.V. Pallardó, P. Sanz and Erwin Knecht are members of the Rare Disease Micro-cluster of VLC Campus of Excellence. This work was supported by grants SAF2008-01338 from the Ministerio de Ciencia e Innovación and financial support from the CIBERER (Biomedical Network Research Center for Rare Diseases). The CIBERER is an initiative of the Instituto de Salud Carlos III and INGENIO 2010Peer reviewe

Acute telomerase components depletion triggers oxidative stress as an early event previous to telomeric shortening

Loss of function of dyskerin (DKC1), NOP10 and TIN2 are responsible for different inheritance patterns of Dyskeratosis congenita (DC; ORPHA1775). They are key components of telomerase (DKC1 and NOP10) and shelterin (TIN2), and play an important role in telomere homeostasis. They participate in several fundamental cellular processes by contributing to Dyskeratosis congenita through mechanisms that are not fully understood. Presence of oxidative stress was postulated to result from telomerase ablation. However, the resulting disturbed redox status can promote telomere attrition by generating a vicious circle, which promotes cellular senescence. This fact prompted us to study if acute loss of DKC1, NOP10 and TINF2 can promote redox disequilibrium as an early event when telomere shortening has not yet taken place. We generated siRNA-mediated (DKC1, NOP10 and TINF2) cell lines by RNA interference, which was confirmed by mRNA and protein expression analyses. No telomere shortening occurred in any silenced cell line. Depletion of H/ACA ribonucleoproteins DKC1 and NOP10 diminished telomerase activity via TERC down-regulation, and produced alterations in pseudouridylation and ribosomal biogenesis. An increase in the GSSG/GSH ratio, carbonylated proteins and oxidized peroxiredoxin-6 was observed, in addition to MnSOD and TRX1 overexpression in the siRNA DC cells. Likewise, high PARylation levels and high PARP1 protein expression were detected. In contrast, the silenced TINF2 cells did not alter any evaluated oxidative stress marker. Altogether these findings lead us to conclude that loss of DKC1 and NOP10 functions induces oxidative stress in a telomere shortening independent manner. Keywords: Aging, Oxidative stress, Antioxidant, Telomeropathies, DNA damag