Nuevos enfoques para el diagnóstico y el control de la dicrocoeliosis, importante parasitosis hepática de los rumiantes

259 p.El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral fue mejorar el diagnóstico de la dicrocoeliosis en sus hospedadores intermediarios y definitivos, mediante técnicas inmunológicas y moleculares, para lo cual se han llevado a cabo los procedimientos que se resumen a continuación. Se ha desarrollado una técnica de PCR para la detección precoz de D. dendriticum en moluscos y hormigas que actúan como hospedadores intermediarios. Asimismo, se han utilizado técnicas de proteómica para conocer las proteínas mayoritarias y antigénicas que se expresan en los antígenos de tegumento y de excreción/secreción del parásito adulto. Por último, mediante la construcción de una genoteca de expresión se ha abordado el estudio, por primera vez, de una colección de EST (Expressed Sequenece Tag), y se han obtenido y evaluado tres proteínas recombinantes para el diagnóstico de la dicrocoeliosis en los hospedadores definitivo

Localización y caracterización de los genes implicados en la síntesis de la bacteriocina Lcn972 en aislados silvestres de Lactococcus Lactis

Motivación: Las bacteriocinas son proteínas sintetizadas por bacterias con actividad antimicrobiana frente a especies relacionadas con la cepa productora. La bacteriocina Lactococina 972 (Lcn972) inhibe la formación del septum en células en división. Su modo de acción se basa en la inhibición de la biosíntesis de péptidoglicano uniéndose de manera específica al lípido II (Martínez et al., 2000).El espectro de actividad es bastante específico, afectando sólo a Lactococcus en división.Los genes que codifican para la síntesis de Lcn 972 así como para la resistencia a la misma se encuentran en un plásmido, pBL1, de 10.9 kD. Lcn 972 es producida por Lactococcus Lactis IPLA 972 (Martínez et al., 1995) aunque recientemente, se han aislados nuevos productores (Alegría et al., 2010). El objetivo de este trabajo es la identificación y caracterización de los genes implicados en la síntesis de Lcn 972 en los nuevos productores aislados.Métodos: Para localizar el gen estructural, se llevó a cabo un análisis del DNA plasmídico de los nuevos productores por hibridación DNA-DNA con el gen estructural de Lcn 972 y, tras el aislamiento de los plásmidos, se secuenciaron. La actividad de la bacteriocina de los diferentes productores fue examinada por el test de difusión en agar y su producción fue cuantificada mediante el método ELISA.Resultados: En 4 de las 5 nuevas cepas productoras, los genes para la producción e inmunidad de Lcn 972 se localizaron en  un plásmido diferente, de mayor tamaño que pBL1. Tras la secuenciación, se comprobó que tanto el gen estructural como la región promotora permanecen idénticas en todas las cepas productoras. La diferencia entre ambos plásmidos radica en la existencia de una secuencia de insercción en el de mayor tamaño. En una de las cinco nuevas cepas productoras, dichos genes se localizaron en pBL1. No se encontraron diferencias significativas en la producción ni en la actividad de la bacteriocina entre ambos plásmidos.Conclusiones: Existen nuevos productores de Lcn 972. En uno de ellos, los genes para la producción e inmunidad de Lcn 972 se encuentran en pBL1. En otras cepas aisladas productoras de Lcn 972, los genes responsables se encuentran en un plásmido de mayor tamaño a pBL1. No hay diferencias contundentes de producción y actividad entre los diferentes plásmido

Zona de transición de una línea ferroviaria situada entre una vía en balasto y una vía en placa de hormigón

Zona de transición de una línea ferroviaria situada entre una vía en balasto y una vía en placa de hormigón, que comprende: - un conjunto de traviesas de hormigón de longitud superior a las traviesas de las vías en placa de hormigón y en balasto, agrupadas en secciones de traviesas de la misma longitud, con longitud creciente desde la vía en balasto a la vía en placa de hormigón, - una lámina de amortiguación de la vibración situada en sentido transversal a la vía en placa de hormigón que se extiende al menos entre la capa de balasto de la zona de transición y la capa de hormigón de la vía en placa de hormigón, - almohadillas de apoyo bajo carril con una rigidez igual o creciente desde la vía en placa de hormigón hacia la vía en balasto, - sendos carriles adicionales internos y - sendos carriles adicionales externos.Solicitud: 201730552 (31.03.2017)Nº Pub. de Solicitud: ES2684429A1 (02.10.2018

Calicophoron daubneyi (Paramphistomidae) in slaughtered cattle in Castilla y León (Spain)

The prevalence and aetiology of natural paramphistomosis was investigated in cattle slaughtered in the Castilla y León region (Spain) over a 3 year-period. The overall prevalence of positive animals was 6.20%. The parasite burden per animal ranged from 8 to 8005 (median = 144) and the ruminal atrium had the highest parasite burden whereas the ruminal dorsal sac the lowest. The prevalence and parasite burden increased with age while these parameters were lower in cattle under intensive management. Calicophoron daubneyi was the only Paramphistomidae species identified using morphoanatomical, histological and molecular methods in the studied animals.This work was supported by grant LE023A10-2 fromJunta de Castilla y León (JCyL). A.M. Martínez-Ibeas was supported by the JCyL andthe European Social Funds (ESF) and J. Benavides by theJAE-Doc programme (CSIC-ESF).Peer Reviewe

Çédille, revista de estudios franceses

Presentació

Proteomic analysis of the tegument and excretory–secretory products of Dicrocoelium dendriticum (Digenea) adult worms

10 páginas, 5 figuras, 2 tablas.Dicrocoeliosis, caused by Dicrocoelium dendriticum, is an important hepatic parasitosis in ruminants, whose immunological diagnosis and control remain unsatisfactory. There are very few studies on the antigens of this trematode and molecular knowledge about it is practically nil. Therefore the aim of this study was to identify the major antigenic proteins in the tegument (TG) and excretory–secretory (ES) antigenic extracts of D. dendriticum. The separation conditions of the protein extracts were optimized using 2-D PAGE; the gels were stained with colloidal Coomassie or transferred to carry out immunodetection with anti-Dicrocoelium dendriticum sera. The proteins of interest excised from the gels were identified by mass spectrometry (MALDI). The proteomic maps of the TG and ES extracts of D. dendriticum were defined first, detecting 332 spots in the TG and 284 in the ES, with a similar distribution in both. A quantity of 29 proteins in the excretion-secretion products and 43 in the teguments were identified first in D. dendriticum, 23 of them antigenic, involved in various processes such as: metabolism, detoxification, chaperone, transport or structural molecules. These results could help us to understand the complex parasite-host relationships, improve the diagnosis of dicroceliosis and help to produce possible vaccines to control it.This study was supported by the Spanish CICYT and the European Social Funds (Project AGL2007-62824) and “Castile and León” Autonomy (Project CSI01A06). Martínez-Ibeas was supported by the “Castilla y León” Autonomy (Spain) and the European Social Funds (Contract for young researchers).Peer reviewe

Detection of Dicrocoelium dendriticum larval stages in mollusc and ant intermediate hosts by PCR, using mitochondrial and ribosomal internal transcribed spacer (ITS-2) sequences

8 páginas, 6 figuras, 1 tabla.The aim of this study was to develop, perfect and validate the PCR (polymerase chain reaction) technique using mitochondrial (mt) and ribosomal (ITS-2) DNA for the accurate identification of Dicrocoelium dendriticum in molluscs and ants, the first and second intermediate hosts, and their early detection. The first primers that were designed amplified a 169 pb mtDNA fragment of D. dendriticum permitted the detection of a single D. dendriticum metacercaria from the Formica rufibarbis and Formica pratensis abdomen, as well as the detection of the brainworm in the head of the ants collected in tetania. Although these primers did not amplify Dicrocoelium chinensis DNA and permitted detected D. dendriticum in the molluscs, they did not discriminate Brachylaimidae metacercariae found in the same mollusc. The PCR that was designed to amplify a 93 bp fragment of the ITS-2 is D. dendriticum specific as it did not amplify D. chinensis, Brachylaimidae and other trematodes. This technique is very sensitive since it permitted the detection of D. dendriticum in the molluscs from the first day post-infection, the brainworm in the head of the ants and only 1 D. dendriticum metacercaria from the abdomen of the ants. Both techniques are important, mainly the latter.This study was supported by the Spanish CICYT (Project AGL2007–62824). Martínez-Ibeas is supported by the ‘Castile and León’ Autonomy (Spain) and the European Social Funds (Contract for young researchers). Martínez- Valladares is supported by the Spanish National Research Council (CSIC) (JAE Doc Contract).Peer reviewe

PCR diagnosis of dicrocoelium dendriticum infection in mollusc and ant intermediate hosts

1 página.-- Trabajo presentado al XII International Congress of Parasitology (Melbourne, Victoria, Australia, 15-20 August, 2010)Dicrocoeliosis, caused by Dicrocoelium dendriticum, is an important hepatic trematodosis which affects a wide range of mammals, mainly ruminants, in Spain and many other countries. To apply sueeessful control programmes against dicroceliosis, prior study of its epidemiology is needed. This requires specific and early diagnosis in mammals, as well as in molluscs and ants, the first and second intermediate hosts, respectively. The aim of this study was to develop an analytical method based on PCR (Polymerase chain reaction) to detect the infection by D. dendriticum in their intermediate hosts. A PCR based on the diversity of nucleotide sequences in mitochondrial DNA among species was carried out. Since no mitochondrial sequenee of D. dendriticum was available, firstly we identified conserved regions of different parasite species with phylogenetic similarity to design general primers which anneal with D. dendriticum DNA. So ten primers,and several combinations, which flanked the large and small rRNA subunits , the NADH dehydrogenase gen and different cytochrome C oxidase subunits were tested. The pair of general primers, which partly flanked the cytochrome C oxidase I and the large rRNA subunits, amplified a band from adult D. dendriticum samples. Once this band was sequenced, internal specific primers were designed fo detect the infection in the intermediate hosts. Using PCR the primers amplified DNA obtained from: D. dendriticum adults, different species of land molluscs experimentally and naturally infected with D. dendriticum and infected ants collected in tetania (in León province, Spain). The PCR products, observed in agarose gel, permitted the detection of D. dentricum sporocysts in mollusc hepatopancreas as well as metacercariae and brainworm in ant abdomen and head, respectively. The specificity of the PCR was also established after testing the primers with other different parasites such as Fasciola hepatica, Calicophoron daubneyi and Brachylaimidae.Study supported by Spanish CICYT, Project AGL2007-62824Peer reviewe

Study of Dicrocoelium dendriticum antigen proteins using bidimensional electrophoresis and mass spectrometry

1 página.-- Trabajo presentado al XII Congreso Ibérico de Parasitología (Zaragoza, 5 al 8 de julio del 2011).This study was to identify, isolate and characterise the antigen proteins of the tegument (TG) and excretion-secretion (ES) extracts of D. dendriticum using bidimensional (2D) electrophoresis and MALDI TOF/TOF mass spectrometry, as a prior stage to studying their specificity and protective capacity against the parasite...Study supported by the Spanish CICYT (Project AGL2007-62824) and Junta de Castilla y León (Project CSIOIAO6; Contract for young researchers).Peer reviewe