Etablierung von biochemischen und strukturbasierten Systemen zur Charakterisierung wirkstoffresistenter EGFR-Mutanten

Die Identifikation von EGFR-Mutationen in Exon19 und Exon21 als prädiktive Biomarker, die mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber EGFR-Inhibitoren der ersten Generation assoziiert werden konnten, leitete einen Paradigmenwechsel in der Behandlung von NSCLC-Patienten ein.[1-2] In entsprechenden Studien konnte retrospektiv gezeigt werden, dass lediglich Tumore auf die Behandlung mit Gefitinib ansprachen, wenn eine somatische EGFR-Mutation vorlag und im Umkehrschluss Patienten ohne die entsprechende Mutation nicht von der Behandlung mit Gefitinib profitierten, obwohl die Tumore von einer Entität des gleichen Gewebetyps abgeleitet wurden.[3-4] Anhand dieses Beispiels wurde einerseits das enorme Potential der zielgerichteten Therapie deutlich, aber auch die Tatsache, dass ein tiefgründiges Verständnis der Tumorbiologie eine Voraussetzung für die erfolgreiche zielgerichtete Krebstherapie darstellt. Mit dem Ziel charakteristische Merkmale der einzelnen EGFR-Mutanten herauszuarbeiten und innerhalb von Optimierungsstudien an neuartigen Inhibitoren SAR-Profile erstellen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene biochemische und strukturbiologische Systeme für Untersuchungen an wirkstoffresistenten Varianten des EGF-Rezeptors etabliert. Dazu wurde im ersten Schritt die Proteinexpression für einzelne Mutanten des EGFRs in Insektenzellen etabliert und optimiert, um im Anschluss diese durch geeignete Reinigungsstrategien in ausreichender Menge und Reinheit zu erhalten. Auf diesem Weg wurden die EGFR-del19, EGFR-del19/G724S und die EGFR-L858R/T790M/C797S Mutanten für biochemische Assays und die EGFR-T790M/E865A/E866A/K867A sowie die EGFR-T790M/V948R Variante für Kristallisationsstudien erhalten. Ferner konnten entsprechende aktivitätsbasierte Assaysysteme etabliert und Kristallisationssysteme für die EGFR-T790M/V948R Mutante entwickelt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung von neuartigen Inhibitoren zur Adressierung der EGFR-T790M Mutante, wobei die kovalente Adressierung des Cys797 in vorangegangenen Studien als entscheidender Faktor für die effiziente Inhibition der Türstehermutante identifiziert und durch die Einführung von Michael-Akzeptorsystemen in verschiedene Gerüstklassen realisiert wurde. Aufgrund des kovalenten Charakters der Bindungsmechanismus ist eine Beurteilung der Aktivität in biochemischen Systemen anhand des IC50-Werts nur schätzungsweise möglich. Daher wurden detaillierte kinetische Bindungsstudien zur Bestimmung der initialen reversiblen Affinität Ki einer Verbindung zum Enzym und der Rate der Inaktivierung kinact herangezogen und distinkte Profile der einzelnen Gerüstklassen ermittelt. So zeigte sich für Pyrazolopyrimidin-basierte Inhibitoren und Pyrimidin-abgeleitete Inhibitoren eine hohe Abhängigkeit der inhibitorischen Wirksamkeit vom kovalenten Charakter der Bindung, was sich in hohen kinact-Werten manifestierte. In Korrelation mit diesen Daten, resultierte die Einführung der C797S-Mutation in einem drastischen Verlust der inhibitorischen Aktivität. Weiterhin wurden Pyrrolopyrimidin-basierte Inhibitoren kinetisch evaluiert, für die eine ausgesprochen hohe reversible Affinität nachgewiesen werden konnte und Ki-Werte der Verbindungen im subnanomolaren Bereich gegenüber der EGFR-L858R/T790M Mutante ermittelt wurden. An dieser Stelle konnte zum ersten Mal eine hohe inhibitorische Potenz gegenüber der EGFR-L858R/T790M/C797S Mutante in biochemischen Assays beobachtet werden, so wurde beispielsweise für den Inhibitor RL2029 ein IC50-Wert von etwa 8 nM festgestellt. Im Folgenden konnte diese Aktivität aber nicht in zelluläre Potenz translatiert werden, welches auf die schlechte Zell-Permeabilität der Verbindungen zurückzuführen sein könnte und einen Ansatzpunkt für weitere Optimierungsstudien darstellt. In dieser Arbeit wurde außerdem eine Durchmusterung der laborinternen Substanzbibliothek nach aktiven Verbindungen gegenüber der PC9-T790M/C797S Zelllinie mit Hilfe der semi-automatisierten Screening-Einheit RASPELD vorgenommen. Hierbei wurden initial 148 Verbindungen identifiziert, die eine Reduktion der Viabilität der untersuchten Zellen um 70% hervorriefen. In weiterführenden Hitvalidierungsstudien wurden fünf interessante Substanzen identifiziert, die EC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich gegenüber EGFR-mutierten Zelllinien zeigten und gleichzeitig keine Aktivität gegenüber EGFR-WT Zelllinien demonstrierten. Jedoch konnte in biochemischen aktivitätsbasierten Assaysystemen keine inhibitorische Aktivität der Hitverbindungen gegenüber den verschiedenen EGFR-Varianten festgestellt werden, sodass Western-Blot Studien angeschlossen werden sollten oder gegebenenfalls andere Zielstrukturen der Verbindungen in Betracht gezogen werden sollten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit erfolgte innerhalb eines Kooperationsprojektes eine tiefgreifende Charakterisierung der kürzlich identifizierten EGFR-del19/G724S Mutation, die in Patienten eine Wirkstoffresistenz gegenüber des Drittgenerationsinhibitors Osimertinib vermittelt. In biochemischen Assays konnte die klinische Beobachtung verifiziert und nachgestellt werden, sodass das etablierte System als Grundlage für Screening-Experimente genutzt werden konnte. Die Durchmusterung einer fokussierten Substanzbibliothek ergab signifikante Unterschiede in der Potenz der einzelnen Generationen an EGFR-Inhibitoren, sodass abgeleitet werden konnte, dass die del19/G724S-Mutation eine Resistenz gegenüber allen bekannten Drittgenerationsinhibitoren vermittelt. Weiterhin konnten Zweitgenerationsinhibitoren wie Afatinib und Poziotinib als potente Inhibitoren identifiziert werden, für die auch in kinetischen Profilierungen eine hohe Affinität (Ki<1 nM) gegenüber der Osimertinib-resistenten Mutation nachgewiesen werden konnte. Schlussendlich konnte die hohe inhibitorische Wirksamkeit des Afatinibs gegenüber der EGFR-del19/G724S Mutante in zelluläre Potenz und in vivo Aktivität gezeigt werden

Mechanistic insight into RET kinase inhibitors targeting the DFG-out conformation in RET-rearranged cancer

Oncogenic fusion events have been identified in a broad range of tumors. Among them, RET rearrangements represent distinct and potentially druggable targets that are recurrently found in lung adenocarcinomas. Here, we provide further evidence that current anti-RET drugs may not be potent enough to induce durable responses in such tumors. We report that potent inhibitors such as AD80 or ponatinib that stably bind in the DFG-out conformation of RET may overcome these limitations and selectively kill RET-rearranged tumors. Using chemical genomics in conjunction with phosphoproteomic analyses in RET-rearranged cells we identify the CCDC6-RETI788N mutation and drug-induced MAPK pathway reactivation as possible mechanisms, by which tumors may escape the activity of RET inhibitors. Our data provide mechanistic insight into the druggability of RET kinase fusions that may be of help for the development of effective therapies targeting such tumors

Analyzing Kinase Similarity in Small Molecule and Protein Structural Space to Explore the Limits of Multi-Target Screening

While selective inhibition is one of the key assets for a small molecule drug, many diseases can only be tackled by simultaneous inhibition of several proteins. An example where achieving selectivity is especially challenging are ligands targeting human kinases. This difficulty arises from the high structural conservation of the kinase ATP binding sites, the area targeted by most inhibitors. We investigated the possibility to identify novel small molecule ligands with pre-defined binding profiles for a series of kinase targets and anti-targets by in silico docking. The candidate ligands originating from these calculations were assayed to determine their experimental binding profiles. Compared to previous studies, the acquired hit rates were low in this specific setup, which aimed at not only selecting multi-target kinase ligands, but also designing out binding to anti-targets. Specifically, only a single profiled substance could be verified as a sub-micromolar, dual-specific EGFR/ErbB2 ligand that indeed avoided its selected anti-target BRAF. We subsequently re-analyzed our target choice and in silico strategy based on these findings, with a particular emphasis on the hit rates that can be expected from a given target combination. To that end, we supplemented the structure-based docking calculations with bioinformatic considerations of binding pocket sequence and structure similarity as well as ligand-centric comparisons of kinases. Taken together, our results provide a multi-faceted picture of how pocket space can determine the success of docking in multi-target drug discovery efforts

Analyzing Kinase Similarity in Small Molecule and Protein Structural Space to Explore the Limits of Multi-Target Screening

While selective inhibition is one of the key assets for a small molecule drug, many diseases can only be tackled by simultaneous inhibition of several proteins. An example where achieving selectivity is especially challenging are ligands targeting human kinases. This difficulty arises from the high structural conservation of the kinase ATP binding sites, the area targeted by most inhibitors. We investigated the possibility to identify novel small molecule ligands with pre-defined binding profiles for a series of kinase targets and anti-targets by in silico docking. The candidate ligands originating from these calculations were assayed to determine their experimental binding profiles. Compared to previous studies, the acquired hit rates were low in this specific setup, which aimed at not only selecting multi-target kinase ligands, but also designing out binding to anti-targets. Specifically, only a single profiled substance could be verified as a sub-micromolar, dual-specific EGFR/ErbB2 ligand that indeed avoided its selected anti-target BRAF. We subsequently re-analyzed our target choice and in silico strategy based on these findings, with a particular emphasis on the hit rates that can be expected from a given target combination. To that end, we supplemented the structure-based docking calculations with bioinformatic considerations of binding pocket sequence and structure similarity as well as ligand-centric comparisons of kinases. Taken together, our results provide a multi-faceted picture of how pocket space can determine the success of docking in multi-target drug discovery efforts

Trisubstituted Pyridinylimidazoles as Potent Inhibitors of the Clinically Resistant L858R/T790M/C797S EGFR Mutant: Targeting of Both Hydrophobic Regions and the Phosphate Binding Site

Inhibition of the epidermal growth factor receptor represents one of the most promising strategies in the treatment of lung cancer. Acquired resistance compromises the clinical efficacy of EGFR inhibitors during long-term treatment. The recently discovered EGFR-C797S mutation causes resistance against third-generation EGFR inhibitors. Here we present a rational approach based on extending the inhibition profile of a p38 MAP kinase inhibitor toward mutant EGFR inhibition. We used a privileged scaffold with proven cellular potency as well as in vivo efficacy and low toxicity. Guided by molecular modeling, we synthesized and studied the structure–activity relationship of 40 compounds against clinically relevant EGFR mutants. We successfully improved the cellular EGFR inhibition down to the low nanomolar range with covalently binding inhibitors against a gefitinib resistant T790M mutant cell line. We identified additional noncovalent interactions, which allowed us to develop metabolically stable inhibitors with high activities against the osimertinib resistant L858R/T790M/C797S mutant

Trisubstituted Pyridinylimidazoles as Potent Inhibitors of the Clinically Resistant L858R/T790M/C797S EGFR Mutant: Targeting of Both Hydrophobic Regions and the Phosphate Binding Site

Inhibition of the epidermal growth factor receptor represents one of the most promising strategies in the treatment of lung cancer. Acquired resistance compromises the clinical efficacy of EGFR inhibitors during long-term treatment. The recently discovered EGFR-C797S mutation causes resistance against third-generation EGFR inhibitors. Here we present a rational approach based on extending the inhibition profile of a p38 MAP kinase inhibitor toward mutant EGFR inhibition. We used a privileged scaffold with proven cellular potency as well as in vivo efficacy and low toxicity. Guided by molecular modeling, we synthesized and studied the structure–activity relationship of 40 compounds against clinically relevant EGFR mutants. We successfully improved the cellular EGFR inhibition down to the low nanomolar range with covalently binding inhibitors against a gefitinib resistant T790M mutant cell line. We identified additional noncovalent interactions, which allowed us to develop metabolically stable inhibitors with high activities against the osimertinib resistant L858R/T790M/C797S mutant

Indazole-Based Covalent Inhibitors To Target Drug-Resistant Epidermal Growth Factor Receptor

The specific targeting of oncogenic mutant epidermal growth factor receptor (EGFR) is a breakthrough in targeted cancer therapy and marks a drastic change in the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). The recurrent emergence of resistance to these targeted drugs requires the development of novel chemical entities that efficiently inhibit drug-resistant EGFR. Herein, we report the optimization process for a hit compound that has emerged from a phenotypic screen resulting in indazole-based compounds. These inhibitors are conformationally less flexible, target gatekeeper mutated drug-resistant EGFR-L858R/T790M, and covalently alkylate Cys797. Western blot analysis, as well as characterization of the binding kinetics and kinase selectivity profiling, substantiates our approach of targeting drug-resistant EGFR-L858R/T790M with inhibitors incorporating the indazole as hinge binder

Inhibitors to Overcome Secondary Mutations in the Stem Cell Factor Receptor KIT

In modern cancer therapy, the use of small organic molecules against receptor tyrosine kinases (RTKs) has been shown to be a valuable strategy. The association of cancer cells with dysregulated signaling pathways linked to RTKs represents a key element in targeted cancer therapies. The tyrosine kinase mast/stem cell growth factor receptor KIT is an example of a clinically relevant RTK. KIT is targeted for cancer therapy in gastrointestinal stromal tumors (GISTs) and chronic myelogenous leukemia (CML). However, acquired resistance mutations within the catalytic domain decrease the efficacy of this strategy and are the most common cause of failed therapy. Here, we present the structure-based design and synthesis of novel type II kinase inhibitors to overcome these mutations in KIT. Biochemical and cellular studies revealed promising molecules for the inhibition of mutated KIT

Structure-Guided Development of Covalent and Mutant-Selective Pyrazolopyrimidines to Target T790M Drug Resistance in Epidermal Growth Factor Receptor

Reversible epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors prompt a beneficial clinical response in non-small cell lung cancer patients who harbor activating mutations in EGFR. However, resistance mutations, particularly the gatekeeper mutation T790M, limit this efficacy. Here, we describe a structure-guided development of a series of covalent and mutant-selective EGFR inhibitors that effectively target the T790M mutant. The pyrazolopyrimidine-based core differs structurally from that of aminopyrimidine-based third-generation EGFR inhibitors and therefore constitutes a new set of inhibitors that target this mechanism of drug resistance. These inhibitors exhibited strong inhibitory effects toward EGFR kinase activity and excellent inhibition of cell growth in the drug-resistant cell line H1975, without significantly affecting EGFR wild-type cell lines. Additionally, we present the in vitro ADME/DMPK parameters for a subset of the inhibitors as well as in vivo pharmacokinetics in mice for a candidate with promising activity profile