Entwicklung und Charakterisierung von neuen und selektiven Inhibitoren für die Ecto-5’-Nucleotidase

Die Ecto-5’-Nucleotidase (CD73, eN), ein Enzym der Familie der Ectonucleotidasen, wird ubiquitär im Körper exprimiert. Das Enzym wird bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen, vor allem bei Hypoxie, Entzündungsreaktionen und Krebs, stark hochreguliert. Damit stellt die eN eine vielversprechende Zielstruktur für die Entwicklung neuer Arzneistoffe, insbesondere für die Immunochemotherapie von Krebs, dar. Besonders gut als Arzneistoffe geeignet sind kleine Moleküle, die peroral appliziert werden können. Bisher sind nur wenige Inhibitoren der eN beschrieben, welche zudem wenig potent und kaum selektiv sind. Die Erforschung und Identifizierung von Inhibitoren, sowie deren strukturelle Optimierung erfordert zunächst geeignete Methoden zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms. Die Etablierung eines eN-Assays wird erschwert durch den niedrigen KM-Wert des Enzyms für das Hauptsubstrat AMP (deutlich unter 50 µM). Dies erfordert eine hohe Assay-Sensitivität mit niedriger Nachweisgrenze. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten zwei Testsysteme etabliert werden. Der Malachitgrün-Assay, eine kolorimetrische Methode, erlaubt die Detektion des bei der enzymatischen Hydrolyse entstehenden Phosphats. Durch Optimierung bisher beschriebener Methoden gelang es, die Empfindlichkeit der Methode deutlich zu verbessern. Dies ermöglicht nun den Einsatz einer relativ geringen Substratkonzentration, was vor allem für die Untersuchung kompetitiver Inhibitoren von Vorteil ist. Der entwickelte Assay ist mit einem Z’-Faktor von 0,8 robust, reproduzierbar und für die Durchführung von Hochdurchsatzverfahren geeignet. Über die Optimierung des Malachitgrün-Assays hinaus konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein ganz neuer, radiometrischer eN-Assay entwickelt, optimiert und validiert werden. Dieser Assay erlaubt es, aufgrund der hohen Empfindlichkeit sogar mit Substratkonzentrationen deutlich unterhalb des KM-Wertes zu arbeiten. Dies ermöglicht auch die Identifizierung schwach wirksamer oder schlecht wasserlöslicher Substrate. Mit einem Z’-Faktor von 0,7 zeigt auch diese Methode eine hohe Robustheit. Im Rahmen einer Screening-Kampagne wurde eine Subbibliothek der institutseigenen Substanzbibliothek untersucht. Hierbei wurden 14 Treffer identifiziert und näher charakterisiert. Sie zeigten eine inhibitorische Aktivität im niedrigen mikromolaren Bereich. In einem weiteren in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Projekt wurden ausgehend von dem bisher potentesten beschriebenen eN-Inhibitor Adenosin-[α,β-methylen]diphosphat (AOPCP) entwickelte Derivate auf ihre inhibitorische Wirkung gegenüber der eN charakterisiert. Basierend auf diesen Ergebnissen war es uns möglich, detaillierte Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen und die Verbindungen entscheidend zu optimieren. Die potenteste Verbindung SB-685a mit einem Ki-Wert von 0.341 nM zeigte damit eine um den Faktor 600 verbesserte inhibitorische Potenz gegenüber der Leitstruktur AOPCP (Ki = 197 nM). Obwohl die von uns optimierten AOPCP-Derivate eine sehr starke inhibitorische Potenz und darüber hinaus eine hohe Selektivität gegenüber anderen Nucleotidasen aufweisen, sind sie für den Einsatz als perorale Arzneimittel ungeeignet, da sie aufgrund der Phosphonat-Reste bei physiologischen pH-Werten negativ geladen sind. Daher wurde neben der Optimierung der AOPCP-Derivate an der Optimierung einer weiteren Strukturklasse von eN-Inhibitoren gearbeitet. Mithilfe eines virtuellen Screenings unter Verwendung eines Homologie-Modells der eN und anschließender In-vitro-Untersuchung der identifizierten Hits konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Sulfonamide als neue eN-Inhibitorklasse beschrieben werden. Die Synthese einer kleinen Bibliothek von Sulfonamid-Derivaten und deren pharmakologische Charakterisierung erlaubte die Aufstellung erster Struktur-Wirkungsbeziehungen (SAR). Wir konnten im Rahmen dieses Projektes die ersten Inhibitoren mit Aktivitäten im niedrigen mikromolaren Bereich identifizieren, die bei physiologischem pH-Wert ungeladen vorliegen. Mit der vorliegenden Arbeit konnten wir die Entwicklung neuer Ecto-5’-Nucleotidase-Inhibitoren, die ein großes Potential zur Immunotherapie von Krebs besitzen, wesentlich voranbringen

X-Ray Co-Crystal Structure Guides the Way to Subnanomolar Competitive Ecto-5 '-Nucleotidase (CD73) Inhibitors for Cancer Immunotherapy

Ecto-5'-nucleotidase (CD73, EC 3.1.3.5) catalyzes the extracellular hydrolysis of AMP yielding adenosine, which induces immunosuppression, angiogenesis, metastasis, and proliferation of cancer cells. CD73 inhibition is therefore proposed as a novel strategy for cancer (immuno)therapy, and CD73 antibodies are currently undergoing clinical trials. Despite considerable efforts, the development of small molecule CD73 inhibitors has met with limited success. To develop a suitable drug candidate, a high resolution (2.05 degrees A) co-crystal structure of the CD73 inhibitor PSB-12379, a nucleotide analogue, in complex with human CD73 is determined. This allows the rational design and development of a novel inhibitor (PSB-12489) with subnanomolar inhibitory potency toward human and rat CD73, high selectivity, as well as high metabolic stability. A co-crystal structure of PSB-12489 with CD73 (1.85 degrees A) reveals the interactions responsible for increased potency. PSB-12489 is the most potent CD73 inhibitor to date representing a powerful tool compound and novel lead structure

Démarche de prévention dans le secteur médico-social : MESOCAP

International audienc

Virtual Screening Identifies Novel Sulfonamide Inhibitors of <i>ecto</i>-5′-Nucleotidase

We aimed to identify inhibitors of <i>ecto</i>-5′-nucleotidase (<i>ecto</i>-5′-NT, CD73), a membrane-bound metallophosphoesterase that is implicated in the control of purinergic receptor signaling and a number of associated therapeutically relevant effects. Currently, only very few compounds, including ADP, its more stable analogue α,β-methylene-ADP, ATP, and anthraquinone derivatives are known to inhibit this enzyme. In the search for inhibitors with more drug-like properties, we applied a model structure-based virtual screening approach augmented by chemical similarity searching. On the basis of this analysis, 51 candidate compounds were finally selected for experimental evaluation. A total of 13 of these molecules were confirmed to have competitive inhibitory activity. The most potent inhibitor, 6-chloro-2-oxo-<i>N</i>-(4-sulfamoylphenyl)-2<i>H</i>-chromene-3-carboxylic acid amide (<b>17</b>), showed an IC₅₀ value of 1.90 μM. In contrast to the nucleotide- and anthraquinone-derived antagonists, the newly identified competitive inhibitors are uncharged at physiological pH values, possess a drug-like structure, and are structurally distinct from known active compounds

α,β-Methylene-ADP (AOPCP) Derivatives and Analogues: Development of Potent and Selective <i>ecto</i>-5′-Nucleotidase (CD73) Inhibitors

<i>ecto</i>-5′-Nucleotidase (<i>e</i>N, CD73) catalyzes the hydrolysis of extracellular AMP to adenosine. <i>e</i>N inhibitors have potential for use as cancer therapeutics. The <i>e</i>N inhibitor α,β-methylene-ADP (AOPCP, adenosine-5′-<i>O</i>-[(phosphonomethyl)­phosphonic acid]) was used as a lead structure, and derivatives modified in various positions were prepared. Products were tested at rat recombinant <i>e</i>N. 6-(Ar)­alkylamino substitution led to the largest improvement in potency. <i>N</i>⁶-Monosubstitution was superior to symmetrical <i>N</i>⁶,<i>N</i>⁶-disubstitution. The most potent inhibitors were <i>N</i>⁶-(4-chlorobenzyl)- (<b>10l</b>, PSB-12441, <i>K</i>_i 7.23 nM), <i>N</i>⁶-phenylethyl- (<b>10h</b>, PSB-12425, <i>K</i>_i 8.04 nM), and <i>N</i>⁶-benzyl-adenosine-5′-<i>O</i>-[(phosphonomethyl)­phosphonic acid] (<b>10g</b>, PSB-12379, <i>K</i>_i 9.03 nM). Replacement of the 6-NH group in <b>10g</b> by O (<b>10q</b>, PSB-12431) or S (<b>10r</b>, PSB-12553) yielded equally potent inhibitors (<b>10q</b>, 9.20 nM; <b>10r</b>, 9.50 nM). Selected compounds investigated at the human enzyme did not show species differences; they displayed high selectivity versus other <i>ecto</i>-nucleotidases and ADP-activated P2Y receptors. Moreover, high metabolic stability was observed. These compounds represent the most potent <i>e</i>N inhibitors described to date