Die Ecto-5’-Nucleotidase (CD73, eN), ein Enzym der Familie der Ectonucleotidasen, wird ubiquitär im Körper exprimiert. Das Enzym wird bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen, vor allem bei Hypoxie, Entzündungsreaktionen und Krebs, stark hochreguliert. Damit stellt die eN eine vielversprechende Zielstruktur für die Entwicklung neuer Arzneistoffe, insbesondere für die Immunochemotherapie von Krebs, dar. Besonders gut als Arzneistoffe geeignet sind kleine Moleküle, die peroral appliziert werden können. Bisher sind nur wenige Inhibitoren der eN beschrieben, welche zudem wenig potent und kaum selektiv sind. Die Erforschung und Identifizierung von Inhibitoren, sowie deren strukturelle Optimierung erfordert zunächst geeignete Methoden zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms. Die Etablierung eines eN-Assays wird erschwert durch den niedrigen KM-Wert des Enzyms für das Hauptsubstrat AMP (deutlich unter 50 µM). Dies erfordert eine hohe Assay-Sensitivität mit niedriger Nachweisgrenze. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten zwei Testsysteme etabliert werden. Der Malachitgrün-Assay, eine kolorimetrische Methode, erlaubt die Detektion des bei der enzymatischen Hydrolyse entstehenden Phosphats. Durch Optimierung bisher beschriebener Methoden gelang es, die Empfindlichkeit der Methode deutlich zu verbessern. Dies ermöglicht nun den Einsatz einer relativ geringen Substratkonzentration, was vor allem für die Untersuchung kompetitiver Inhibitoren von Vorteil ist. Der entwickelte Assay ist mit einem Z’-Faktor von 0,8 robust, reproduzierbar und für die Durchführung von Hochdurchsatzverfahren geeignet. Über die Optimierung des Malachitgrün-Assays hinaus konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein ganz neuer, radiometrischer eN-Assay entwickelt, optimiert und validiert werden. Dieser Assay erlaubt es, aufgrund der hohen Empfindlichkeit sogar mit Substratkonzentrationen deutlich unterhalb des KM-Wertes zu arbeiten. Dies ermöglicht auch die Identifizierung schwach wirksamer oder schlecht wasserlöslicher Substrate. Mit einem Z’-Faktor von 0,7 zeigt auch diese Methode eine hohe Robustheit. Im Rahmen einer Screening-Kampagne wurde eine Subbibliothek der institutseigenen Substanzbibliothek untersucht. Hierbei wurden 14 Treffer identifiziert und näher charakterisiert. Sie zeigten eine inhibitorische Aktivität im niedrigen mikromolaren Bereich. In einem weiteren in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Projekt wurden ausgehend von dem bisher potentesten beschriebenen eN-Inhibitor Adenosin-[α,β-methylen]diphosphat (AOPCP) entwickelte Derivate auf ihre inhibitorische Wirkung gegenüber der eN charakterisiert. Basierend auf diesen Ergebnissen war es uns möglich, detaillierte Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen und die Verbindungen entscheidend zu optimieren. Die potenteste Verbindung SB-685a mit einem Ki-Wert von 0.341 nM zeigte damit eine um den Faktor 600 verbesserte inhibitorische Potenz gegenüber der Leitstruktur AOPCP (Ki = 197 nM). Obwohl die von uns optimierten AOPCP-Derivate eine sehr starke inhibitorische Potenz und darüber hinaus eine hohe Selektivität gegenüber anderen Nucleotidasen aufweisen, sind sie für den Einsatz als perorale Arzneimittel ungeeignet, da sie aufgrund der Phosphonat-Reste bei physiologischen pH-Werten negativ geladen sind. Daher wurde neben der Optimierung der AOPCP-Derivate an der Optimierung einer weiteren Strukturklasse von eN-Inhibitoren gearbeitet. Mithilfe eines virtuellen Screenings unter Verwendung eines Homologie-Modells der eN und anschließender In-vitro-Untersuchung der identifizierten Hits konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Sulfonamide als neue eN-Inhibitorklasse beschrieben werden. Die Synthese einer kleinen Bibliothek von Sulfonamid-Derivaten und deren pharmakologische Charakterisierung erlaubte die Aufstellung erster Struktur-Wirkungsbeziehungen (SAR). Wir konnten im Rahmen dieses Projektes die ersten Inhibitoren mit Aktivitäten im niedrigen mikromolaren Bereich identifizieren, die bei physiologischem pH-Wert ungeladen vorliegen. Mit der vorliegenden Arbeit konnten wir die Entwicklung neuer Ecto-5’-Nucleotidase-Inhibitoren, die ein großes Potential zur Immunotherapie von Krebs besitzen, wesentlich voranbringen
