Avaliação do papel dos receptores de reconhecimento de padrões Dectina-2 e Dectina-3 na infecção experimental por Paracoccidioides brasiliensis

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada pelo fungo dimórfico do gênero Paracoccidioides spp., podendo afetar tanto indivíduos imunocomprometidos como aqueles imunocompetentes. A PCM tem alta incidência em países da América Latina, principalmente no Brasil. O perfil de resposta Th1 está associado a uma maior proteção contra o P. brasiliensis e o envolvimento de células da resposta imune inata é essencial para o direcionamento dessa resposta. Receptores de Reconhecimento Padrão (PRRs) são importantes para o reconhecimento inicial de patógenos, e lectinas do tipo C, um tipo de PRR, são cruciais no reconhecimento de fungos. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel dos receptores Dectina-2 e Dectina-3 na infecção por P. brasiliensis. Células dendríticas derivadas de medula óssea (BMDCs) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) de linhagens de camundongos do tipo selvagem e deficientes de cada receptor foram infectadas por P. brasiliensis para as análises in vitro. Para a verificação de resposta in vivo, camundongos selvagens e deficientes de Dectina-2 ou Dectina-3 foram infectados pelo fungo para a averiguação de suas sobrevivências. Por fim, infectou-se novamente os animais deficientes de Dectina-2 para coleta de órgãos e análise de UFC, histopatologia e citocinas. Fagócitos deficientes de Dectina-2 produziram significativamente menor quantidade de citocinas (TNF- α, IL-6, IL-1β e IL-10) em em comparação com os selvagens e BMDMs deficientes apresentaram menor capacidade fagocítica e fungicida. Não houve detecção de atividade complementar entre os receptores estudados. Linfócitos T selvagens cultivados com BMDCs deficientes de Dectina-2 produziram menores quantidades de IFN-γ e maiores quantidades de IL-13, demonstrando a relevância de Dectina-2 na indução de resposta imune protetora contra P. brasiliensis em modelos de infecção in vitro. Os animais deficientes de Dectina-2 apresentaram menor produção de citocinas pró-inflamatórias e maior produção daquelas reguladoras, fazendo com que houvesse maior detecção de UFC em seus pulmões e resultando em uma sobrevivência significativamente afetada. Por sua vez, as células deficientes de Dectina-3 não apresentaram diferença significativa de produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias, fagocitose e atividade fungicida em relação ao controle. Além disso, os camundongos infectados deficientes do receptor não apresentaram maior susceptibilidade diante da infecção por P. brasiliesis. Em conjunto, tais resultados indicam que Dectina-2 – e não Dectina 3 - desempenha um importante papel na indução de resposta imune protetora contra P. brasiliensis.Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by the dimorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp., which may affect both immunocompromised and immunocompetent individuals. PCM has a high incidence in Latin American, mainly in Brazil. The Th1 immune response is associated with a greater protection against the desease and the involvement of the innate immunity is essential for targeting this response. Pattern Recognition Receptors (PRRs) are important for the initial recognition of pathogens, and C type lectins (CLRs) are crucial in the recognition of fungi. Thus, the objective of the study is to evaluate the role of Dectin-2 and Dectin-3 in P. brasiliensis infection. Dectin-2 and Dectina-3 knockout BMDCs and BMDMs were infected with the fungus for the in vitro analyses. For the in vivo analysis, Dectin-2 and Dectin-3 knockout mice were infected by P. brasiliensis and their survival were assessed. Furthermore, Dectin-2 knockout mice were infected and sacrificed with 30 and 60 days after infection for CFU, histophatology analysis and cytokine production in lungs and liver. Dectin-2 knockout phagocytes produced significantly lower amounts of cytokines (TNF-α, IL-6 IL-1β and IL-10) compared to wild-type and Dectin-2 deficient BMDMs had lower phagocytic and fungicidal capacity. There was no detection of complementary activity among the CLRs studied. T lymphocytes cultured with Dectin-2 knockout BMDCs produced lower amounts of IFN-γ and higher amounts of IL-13, demonstrating the relevance of Dectin-2 in inducing a protective immune response against P. brasiliensis in vitro. Dectin-2-deficient mice had lower production of pro-inflammatory cytokines and increased production of the regulatory ones. They presented higher CFUs in their lungs and a significantly lower survival compared to the wild-type mice. Dectin-3-deficient cells did not show significant difference in cytokine production, expression of co-stimulatory molecules, phagocytosis and fungicidal activity in relation to the control. Moreover, Dectin-3 knockout mice did not present greater mortality compared to wild type. Taken together, these results indicate that Dectin-2 – and not Dectin-3 – has an important role in inducing a protective immune response against P. brasiliensis

Acetonic Fraction of Bidens pilosa Enriched for Maturase K Is Able to Control Cerebral Parasite Burden in Mice Experimentally Infected With Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii infection can cause abortions or congenital infection for a vast number of domestic animals and humans, leading to economic loss in veterinary sciences, as well as severe consequences for immunocompromised patients. Bidens pilosa Linné has been used in ethnopharmacology for treatment of diseases, as malaria, diabetes and hepatitis, in addition to its use as antioxidant, antiallergic, anti-inflammatory, and antiviral. The components of this plant have never been studied before for treatment of toxoplasmosis, and the conventional drugs currently used to treat this disease have high degree of toxicity. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of B. pilosa against T. gondii, by analyzing a total extract of this plant in parallel with a fraction obtained by precipitation in acetone. Also, it was assessed if the acetonic fraction could present lectinic activity, followed by its identification by mass spectrometry. It was observed with the experimental models designed that both total extract and acetonic fraction of B. pilosa were able to control T. gondii infection by in vitro and in vivo experiments, in addition to their low toxicity to host cells. Both total extract and acetonic fraction of this plant display capacity to impair replication of T. gondii tachyzoites. Interesting, the B. pilosa acetonic fraction treatment for 10 days after infection decreases significantly the number of T. gondii brain cyst in comparison with controls. The protein isolated from B. pilosa acetonic fraction was characterized as a novel lectin identified as maturase K. Taken together, these findings open new perspectives to treat patients infected by T. gondii. Future studies will be necessary to investigate the precise mechanism underlying the control of T. gondii infection to impair the replication of this parasite in the host cells after treatment with B. pilosa maturase K

Efeito adjuvante e potencial imunoestimulador das lectinas de Artocarpus integrifolia (KM+ e Jacalina) e Synadenium carinatum (ScLL) na imunização de camundongos contra Neospora caninum

Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and have important role in modulation of the immune response. KM+ and Jacalin (JAC) are lectins from the seeds from jackfruit (Artocarpus integrifolia) and ScLL is a lectin from the Synadenium carinatum latex. Neospora caninum is an apicomplexan parasite that causes neuromuscular disease in dogs and reproductive disorders in cattle, with serious economic impact on the livestock industry. The immunestimulatory role of plant lectins has been investigated in several parasitic infections, but not in neosporosis. This study aimed to evaluate the adjuvant effect and the immunestimulatory potential of KM+, JAC and ScLL in immunization of mice against neosporosis. C57BL 6 mouse groups were subcutaneously immunized three times at 15-day intervals with Neospora lysate antigen (NLA) associated with lectins (NLA+KM, NLA+JAC and NLA+ScLL groups), NLA alone, lectins alone (KM, JAC and ScLL groups), and PBS group (infection control). Animals were challenged with Nc-1 isolate (2x107 tachyzoites) and evaluated for morbidity, mortality, specific antibody response, cytokine production by spleen cells, cerebral parasite burden and histopathological lesions. Serological assays demonstrated higher levels of IgG to N. caninum for NLA+KM and NLA+ScLL than NLA+JAC and NLA groups. NLA+KM group induced higher levels of IgG2a isotype whereas NLA+ScLL induced higher levels of IgG1 isotype. In all groups, IgG1 response was higher than IgG2a response before and after challenge, but the IgG2a/IgG1 ratio increased after challenge in NLA+KM, NLA+ScLL and KM groups. Cytokine production after in vitro antigenic stimulation showed that NLA+KM induced high levels of IFN-g and IL-10, presenting the highest IFN-g/IL-10 ratio, followed by NLA+ScLL group, indicating a pattern of immune response toward Th1 type. NLA+JAC induced low levels of these cytokines and the lowest IFN-g/IL-10 ratio in relation to other groups, indicating a profile of Th2 type immune response. After parasite challenge, NLA+KM mice showed the highest survival with low brain parasite burden and moderate tissue inflammation, whereas NLA+ScLL mice presented intermediate survival with low brain parasite burden and low scores of morbidity and inflammation. NLA+JAC group exhibited intermediate survival, but with the highest brain parasite burden and mild inflammation. In conclusion, KM+ and ScLL lectins showed suitable adjuvant effect by increasing NLA immunogenicity and immunostimulatory role by conferring partial protection of mice immunized and challenged with lethal dose of N. caninum, while the JAC lectin showed no adequate adjuvant effect in the immunization against neosporosis.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas GeraisMestre em Imunologia e Parasitologia AplicadasLectinas são proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e possuem importantes papéis na modulação da resposta imune. KM+ e Jacalina (JAC) são lectinas da semente da jaca (Artocarpus integrifolia) e ScLL é uma lectina do látex da planta Synadenium carinatum. Neospora caninum é um parasito do filo Apicomplexa que causa doença neuromuscular em cães e desordens reprodutivas em bovinos, causando sério impacto econômico na indústria agropecuária. O papel imunoestimulador de lectinas de plantas tem sido investigado em diversas infecções parasitárias, mas não na neosporose. Esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito adjuvante e o potencial imunoestimulador de KM+, JAC e ScLL na imunização de camundongos contra a neosporose. Grupos de camundongos C57BL/6 foram imunizados subcutaneamente por três vezes, em intervalos de quinze dias, com o antígeno de lisado total de Neospora (NLA) associado com as lectinas (grupos NLA+KM, NLA+JAC, NLA+ScLL), NLA somente, lectinas somente (KM, JAC e ScLL), além do grupo PBS (controle da infecção). Os animais foram desafiados com isolado Nc-1 (2x107 taquizoítas) e avaliados quanto aos escores de morbidade, mortalidade, resposta imune humoral específica, produção de citocinas por células do baço, carga parasitária cerebral e lesões histopatológicas. Resultados sorológicos demonstraram maiores níveis de IgG anti N. caninum produzidos pelos animais dos grupos NLA+KM e NLA+ScLL que NLA+JAC e NLA somente. O grupo NLA+KM induziu maiores níveis do isotipo IgG2a, enquanto NLA+ScLL induziu maiores níveis do isotipo IgG1. Em todos os grupos, a resposta de IgG1 foi maior do que de IgG2a antes e após o desafio, porém a razão IgG2a/IgG1 aumentou após o desafio nos grupos NLA+KM, NLA+ScLL e KM. A produção de citocinas após o estímulo antigênico in vitro demonstrou que NLA+KM induziu altos níveis de IFN-g e IL-10, apresentando a maior razão IFN-g/IL-10, seguido pelo grupo NLA+ScLL, indicando um padrão de resposta imune direcionado ao perfil Th1. NLA+JAC induziu baixos níveis destas citocinas e menor razão IFN-g/IL-10 em relação aos demais grupos, indicando um padrão de resposta imune do tipo Th2. Após o desafio com o parasito, camundongos do grupo NLA+KM apresentaram a maior sobrevida com baixa carga parasitária cerebral e moderada inflamação tecidual, enquanto animais imunizados com NLA+ScLL apresentaram sobrevida intermediária com baixa carga parasitária cerebral e baixos escores de morbidade e inflamação. O grupo NLA+JAC exibiu sobrevida intermediária, mas com alta carga parasitária cerebral e suave inflamação. Em conclusão, as lectinas KM+ e ScLL mostraram ser adjuvantes satisfatórios por aumentar a imunogenicidade do NLA e apresentaram efeito imunoestimulador por conferir proteção parcial dos camundongos imunizados e desafiados com dose letal de N. caninum, enquanto a lectina Jacalina não produziu efeito adjuvante suficiente na imunização contra a neosporose