Biological evaluation of the anticancer activity of bioactive natural products, their analogues and formulations

Cancer is one of the deadliest diseases worldwide and though novel treatments consecutively arise the survival rate remains low. Thus, there is an urgent need to develop new drugs suitable for each cancer type. Natural products and especially phytochemical substances constitute a huge source of diverse and bioactive compounds. Even though many of them until now, like vinblastine, paclitaxel and irinotecan, have been approved for cancer treatment the research interest in phytochemical compounds has been decreased in the last years due to various difficulties like their challenging isolation/synthesis and low bioavailability. However, deeper knowledge of their bioactivity as well as of their capacity for derivatization/carrier inclusion may optimize their efficacy and provide novel lead molecules for anticancer drug development.The first part describes the interaction of rosmarinic acid and its two building blocks, caffeic and salvianic acid, with serum albumin. The three interactions are investigated through fluorescence spectroscopy, STD and NOESY NMR spectroscopy, isothermal titration calorimetry (ITC) and molecular docking to map their structural, thermodynamic and binding characteristics. The strongest affinity to serum albumin was exhibited by rosmarinic acid, while the affinities of caffeic and salvianic acid were much weaker, indicating that structural complexity can lead to differential binding properties.The second part describes the inclusion complexes of rosmarinic and caffeic acid with the 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and the chemical derivatization into ester and amide analogues of rosmarinic acid. The structural characteristics, thermodynamic and affinity parameters of the two complexes are characterized through solid and liquid state NMR spectroscopy, ITC and mass spectrometry revealing 1:1 complexes with moderate affinities. As a result, 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin could serve as a carrier for both molecules and potentially increase their stability and biovailability in vivo. Furthermore, the esterification and amidification of rosmarinic acid increases its cellular uptake which is hampered due to the negative charge of its carboxylic group. The enhanced uptake is, also, reflected in the increased ability of the analogues to protect Jurkat cells from the H2O2-induced DNA damage and apoptosis and in the increased ability to reduce the intracellular levels of labile iron. The ester derivatives displayed greater cellular uptake and antioxidant activity compared to the amide derivatives, leading to the estimation that the hydrolysis of the ester bonds by the intracellular esterases can result to higher accumulation of rosmarinic acid into the cells.Finally, the third part is about the study of a quercetin methylated analogue showing much higher antiproliferative properties than the parent compound against the DLD1 colon cancer cells. After the screening of 8 methylated quercetin analogues, one showed a 44-fold lower IC50 compared to quercetin. Its way of action was studied through proliferation, apoptosis and migration assays leading to the conclusion that it inhibits the cell growth through the inhibition of proliferation. Furthermore, it was investigated whether the methylated compound retains the ability of quercetin to act on angiogenic molecular mechanisms in endothelial cells (HUVECs). Similar to quercetin, the methylated compound inhibits the VEGF-induced survival and proliferation of HUVECs.Ο καρκίνος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες ασθένειες παγκοσμίως και παρ’ όλο που καινοτόμες θεραπείες αναπτύσσονται συνεχώς το ποσοστό επιβίωσης παραμένει χαμηλό. Έτσι, η ανάγκη για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για κάθε τύπο καρκίνου παραμένει επιτακτική. Τα φυσικά προϊόντα και ειδικά οι φυτοχημικές ενώσεις αποτελούν τεράστια πηγή ποικίλων και βιοδραστικών μορίων. Αν και αρκετά από αυτά μέχρι στιγμής, όπως η βινμπλαστίνη, η πακλιταξέλη και η ιρινοτεκάνη, έχουν εγκριθεί για τη θεραπεία καρκίνων το ερευνητικό ενδιαφέρον ως προς τις φυτοχημικές ενώσεις έχει μειωθεί τα τελευταία χρόνια εξαιτίας διαφόρων δυσκολιών όπως η απαιτητική απομόνωση/σύνθεση και η χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα τους. Ωστόσο, η απόκτηση βαθύτερης γνώσης της βιοδραστικότητας της αλλά και της δυνατότητας της δομικής τους τροποποίησης/ του εγκλεισμού σε φορείς μπορούν να βελτιστοποιήσουν τη βιοδραστικότητα τους και να προσφέρουν καινοτόμα μόρια-οδηγούς στον τομέα της ανάπτυξης αντικαρκινικών φαρμάκων.Το πρώτο μέρος περιγράφει την αλληλεπίδραση του ροσμαρινικού οξέος και των δύο δομικών υπομονάδων του, καφεϊκό και σαλβιανικό οξύ, με την αλβουμίνη του ορού. Οι τρεις αλληλεπιδράσεις εξετάζονται μέσω φθορισμομετρίας, STD και NOESY NMR φασματοσκοπίας, θερμιδομετρίας ισόθερμης τιτλοδότησης (ΙΤC) και προσομοίωσης Μοριακής Πρόσδεσης έτσι ώστε να χαρτογραφηθούν τα δομικά και θερμοδυναμικά χαρακτηριστικά τους καθώς και ο τρόπος πρόσδεσης τους. Ισχυρότερη πρόσδεση στην αλβουμίνη επέδειξε το ροσμαρινικό οξύ, καθώς οι αλληλεπιδράσεις του καφεϊκού και σαλβιανικού οξέος ήταν πολύ πιο αδύναμες, υποδεικνύοντας πως η δομική πολυπλοκότητα μπορεί να οδηγήσει σε διαφοροποιημένες ιδιότητες πρόσδεσης.Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται τα σύμπλοκα εγκλεισμού του ροσμαρινικού και του καφεϊκού οξέος με την 2-ύδροξυ-πρόπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη και η χημική τροποποίηση του ροσμαρινικού οξέος σε εστερικά και αμιδικά παράγωγα. Τα δομικά χαρακτηριστικά, οι θερμοδυναμικές παράμετροι και η ισχύς των δύο συμπλόκων χαρακτηρίζονται μέσω φασματοσκοπίας NMR στερεής και υγρής κατάστασης, ITC και φασματομετρία μαζών αποκαλύπτοντας σύμπλοκα μοριακής αναλογίας 1:1 με αλληλεπιδράσεις μέτριας ισχύος. Συμπερασματικά, η 2-ύδροξυ-πρόπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φορέας των δύο μορίων και δυνητικά να αυξήσει τη σταθερότητα και τη βιοδιαθεσιμότητα τους in vivo. Επιπρόσθετα, η εστεροποίηση και η αμιδίωση του ροσμαρινικού οξέος αυξάνει την κυτταρική του πρόσληψη η οποία εμποδίζεται από το αρνητικό φορτίο που του επιφέρει η καρβοξυλική του ομάδα. Η ενισχυμένη κυτταρική πρόσληψη αντικατοπτρίζεται, επίσης, στην αυξημένη ικανότητα των παραγώγων να προστατέψουν τα κύτταρα Jurkat από τις επαγόμενες από το H2O2 βλάβες στο DNA και την απόπτωση αλλά και στην αυξημένη ικανότητα μείωσης των ενδοκυτταρικών επιπέδων του καταλυτικά ενεργού σιδήρου. Τα εστερικά παράγωγα έδειξαν μεγαλύτερη κυτταρική πρόσληψη και αντιοξειδωτική ιδιότητα σε σχέση με τα αμιδικά οδηγώντας στην εκτίμηση πως η υδρόλυση των εστερικών τους δεσμών από τις ενδοκυττάριες εστεράσες μπορούν να επιφέρουν υψηλότερη συσσώρευση του ροσμαρινικού οξέος στα κύτταρα.Τέλος, το τρίτο μέρος αναφέρεται στη μελέτη ενός μεθυλιωμένου ανάλογου μορίου της κερσετίνης το οποίο επέδειξε πολύ πιο υψηλή αντιπολλαπλασιαστική ικανότητα συγκριτικά με την κερσετίνη έναντι των καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου DLD1. Αφού εξετάσθηκε η δράση 8 μεθυλιωμένων αναλόγων της κερσετίνης, ένα από αυτά έδειξε 44 φορές χαμηλότερη τιμή IC50 σε σχέση με αυτήν της κερσετίνης. Ο τρόπος δράσης του μελετήθηκε με τεχνικές για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης και της μετανάστευσης οδηγώντας στο συμπέρασμα πως μειώνει την κυτταρική ανάπτυξη μέσω αναστολής του πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, μελετήθηκε αν το μεθυλιωμένο παράγωγο διατηρεί την ικανότητα της κερσετίνης να επιδρά σε αγγειογενετικούς μοριακούς μηχανισμούς των ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVECs). Ομοίως της κερσετίνης, το μεθυλιωμένο παράγωγο αναστέλλει την επαγόμενη από τον VEGF επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των HUVECs

Functional components of carob fruit: linking the chemical and biological space

The contribution of natural products to the drug-discovery pipeline has been remarkable since they have served as a rich source for drug development and discovery. Natural products have adapted, during the course of evolution, optimum chemical scaffolds against a wide variety of diseases, including cancer and diabetes. Advances in high-throughput screening assays, assisted by the continuous development on the instrumentation’s capabilities and omics, have resulted in charting a large chemical and biological space of drug-like compounds, originating from natural sources. Herein, we attempt to integrate the information on the chemical composition and the associated biological impact of carob fruit in regards to human health. The beneficial and health-promoting effects of carob along with the clinical trials and the drug formulations derived from carob’s natural components are presented in this review

Lipophilic ester and amide derivatives of rosmarinic acid protect cells against H2O2-induced DNA damage and apoptosis: The potential role of intracellular accumulation and labile iron chelation

Phenolic acids represent abundant components contained in human diet. However, the negative charge in their carboxylic group limits their capacity to diffuse through biological membranes, thus hindering their access to cell interior. In order to promote the diffusion of rosmarinic acid through biological membranes, we synthesized several lipophilic ester- and amide-derivatives of this compound and evaluated their capacity to prevent H2O2-induced DNA damage and apoptosis in cultured human cells. Esterification of the carboxylic moiety with lipophilic groups strongly enhanced the capacity of rosmarinic acid to protect cells. On the other hand, the amide-derivatives were somewhat less effective but exerted less cytotoxicity at high concentrations. Cell uptake experiments, using ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS), illustrated different levels of intracellular accumulation among the ester- and amide-derivatives, with the first being more effectively accumulated, probably due to their extensive hydrolysis inside the cells. In conclusion, these results highlight the hitherto unrecognized fundamental importance of derivatization of diet-derived phenolic acids to unveil their biological potential

Unveiling the interaction profile of rosmarinicacid and its bioactive substructures with serumalbumin

Rosmarinic acid, a phytochemical compound, bears diverse pharmaceutical profile. It is composed by two building blocks: caffeic acid and a salvianic acid unit. The interaction profile, responsible for the delivery of rosmarinic acid and its two substructure components by serum albumin remains unexplored. To unveil this, we established a novel low-cost and efficient method to produce salvianic acid from the parent compound. To probe the interaction profile of rosmarinic acid and its two substructure constituents with the different serum albumin binding sites we utilised fluorescence spectroscopy and competitive saturation transfer difference NMR experiments. These studies were complemented with transfer NOESY NMR experiments. The thermodynamics of the binding profile of rosmarinic acid and its substructures were addressed using isothermal titration calorimetry. In silico docking studies, driven by the experimental data, have been used to deliver further atomic details on the binding mode of rosmarinic acid and its structural component

Chemical Profiling, Bioactivity Evaluation and the Discovery of a Novel Biopigment Produced by <i>Penicillium purpurogenum</i> CBS 113139

Biobased pigments are environmentally friendly alternatives to synthetic variants with an increased market demand. Production of pigments via fermentation is a promising process, yet optimization of the production yield and rate is crucial. Herein, we evaluated the potential of Penicillium purpurogenum to produce biobased pigments. Optimum sugar concentration was 30 g/L and optimum C:N ratio was 36:1 resulting in the production of 4.1–4.5 AU (namely Pigment Complex A). Supplementation with ammonium nitrate resulted in the production of 4.1–4.9 AU (namely Pigment Complex B). Pigments showed excellent pH stability. The major biopigments in Pigment Complex A were N-threonyl-rubropunctamin or the acid form of PP-R (red pigment), N-GABA-PP-V (violet pigment), PP-O (orange pigment) and monascorubrin. In Pigment Complex B, a novel biopigment annotated as N-GLA-PP-V was identified. Its basic structure contains a polyketide azaphilone with the same carboxyl-monascorubramine base structure as PP-V (violet pigment) and γ-carboxyglutamic acid (GLA). The pigments were not cytotoxic up to 250 μg/mL

. Inclusion of Quercetin in Gold Nanoparticles Decorated with Supramolecular Hosts Amplifies Its Tumor Targeting Properties

Despite the anticancer potential of natural products (NPs), their limited bioavailability necessitates laborious derivatization or covalent conjugation to delivery vehicles. To unleash their potential we developed a nanohybrid delivery platform with noncovalently tunable surface. Initially, the active compound was encapsulated in a macrocycle, p-sulphonatocalix[4]arene, enabling a 62,000-fold aqueous solubility amplification as also a 2.9-fold enhancement in its cytotoxicity with respect to the parent compound in SW-620 colon cancer cells. A pH stimuli responsive behavior was recorded for this formulate, where a programmable release of quercetin from the macrocycle was monitored in acidic environment. Then, a nanoparticle gold core was decorated with calixarene hosts to accommodate non-covalently NPs. The loaded nanocarrier with the NP quercetin dramatically enhanced the cytotoxicity (&gt;50 fold) of the parent NP in colon cancer and altered its cell membrane transport mode. In vivo experiments in a mouse 4T1 tumor model showed a reduction of tumor volume in mice treated with quercetin-loaded nanoparticles without apparent toxic effects. Further analysis of the tumor-derived RNA highlighted that treatment with quercetinloaded nanoparticles altered the expression of 27 genes related to apoptosis