Bioquímica de virus: estructura de la envoltura del virus Junín

Los estudios sobre el virus Junín y los demás miembros de la familia Arenaviridae han permitido dilucidar distintos aspectos de la composición, estructura, capacidad antigénica e infectiva de los mismos. Así, como antes se expresara, desde el punto de vista de su composición bioquímica se han estudiado y se siguen estudiando distintas características de las proteínas y ácidos nucleicos virales. Sin embargo, hasta la fecha de comenzarse este trabajo no se había encarado el estudio de los componentes lipídicos de los viriones, no obstante existir evidencias que indican que los mismos juegan un rol importante en el establecimiento de las infecciones virales. En este sentido, de la revisión bibliográfica precedente se desprende que en muchos casos al estudiar la composición lipídica de los virus en comparación con la composición lipídica de las diferentes fracciones celulares se pudo llegar a determinar el modo en que algunos viriones adquieren su envoltura. Con estos conocimientos comenzaron a tener explicación algunas de las etapas implicadas en la morfogénesis de los mismos . Por estas razones hemos encarado el estudio de los componentes fosfolipídicos de los arenavirus y de las diferentes fracciones de las células huéspedes. Tratando de hacer un aporte útil a los conocimientos sobre fiebre hemorrágica argentina comenzamos estudiando particularmente a la cepa patógena MC2 del virus Junín, pero luego ante los resultados obtenidos y la ausencia de datos para los de más miembros de la familia, los estudios se extendieron a la cepa atenuada XJCl3 del virus Junín y a los virus Tacaribe y Pichindé. Los resultados obtenidos y las características de los sistemas utilizados se analizan a lo largo de cinco capítulos. En el primero se exponen las razones que llevaron a la elección de las técnicas de cromatografía mono y bidireccional en capa fina y la técnica de autorradiografía necesarias para el análisis de los fosfolípidos virales y celulares. Se describen además, las características que presentan al aplicarlas al presente sistema de estudio. En el segundo capítulo se analizan estadísticamente los resultados logrados al estudiar comparativamente los fosfolípidos de los arenavirus mencionados y las células huéspedes enteras, infectadas con ellos o falsamente infectadas, indicándose cómo y por qué se aplica la metodología estadística elegida. El tercer capítulo se discute la puesta a punto y la e- lección de las distintas técnicas destinadas a separar y caracterizar membrana plasmática de retículo endoplásmico. En el cuarto capítulo se analizan los resultados obteni dos al separar y caracterizar membrana plasmática y retículo endoplásmico de células infectadas con el virus Junín y de las células no infectadas. En el quinto capítulo se analizan estadísticamente los resultados obtenidos al estudiar la composición fosfolipídica de la membrana plasmática y de retículo endoplásmico de las células infectadas con el virus Junín y de las células control no infectadas. Se analiza también la relación que existe entre los fosfolípidos virales y los de las distintas fraccio nes celulares. Finalmente se presenta una interpretación de los resultados obtenidos.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM).Facultad de Ciencias Exacta

Bioquímica de virus: estructura de la envoltura del virus Junín

Los estudios sobre el virus Junín y los demás miembros de la familia Arenaviridae han permitido dilucidar distintos aspectos de la composición, estructura, capacidad antigénica e infectiva de los mismos. Así, como antes se expresara, desde el punto de vista de su composición bioquímica se han estudiado y se siguen estudiando distintas características de las proteínas y ácidos nucleicos virales. Sin embargo, hasta la fecha de comenzarse este trabajo no se había encarado el estudio de los componentes lipídicos de los viriones, no obstante existir evidencias que indican que los mismos juegan un rol importante en el establecimiento de las infecciones virales. En este sentido, de la revisión bibliográfica precedente se desprende que en muchos casos al estudiar la composición lipídica de los virus en comparación con la composición lipídica de las diferentes fracciones celulares se pudo llegar a determinar el modo en que algunos viriones adquieren su envoltura. Con estos conocimientos comenzaron a tener explicación algunas de las etapas implicadas en la morfogénesis de los mismos . Por estas razones hemos encarado el estudio de los componentes fosfolipídicos de los arenavirus y de las diferentes fracciones de las células huéspedes. Tratando de hacer un aporte útil a los conocimientos sobre fiebre hemorrágica argentina comenzamos estudiando particularmente a la cepa patógena MC2 del virus Junín, pero luego ante los resultados obtenidos y la ausencia de datos para los de más miembros de la familia, los estudios se extendieron a la cepa atenuada XJCl3 del virus Junín y a los virus Tacaribe y Pichindé. Los resultados obtenidos y las características de los sistemas utilizados se analizan a lo largo de cinco capítulos. En el primero se exponen las razones que llevaron a la elección de las técnicas de cromatografía mono y bidireccional en capa fina y la técnica de autorradiografía necesarias para el análisis de los fosfolípidos virales y celulares. Se describen además, las características que presentan al aplicarlas al presente sistema de estudio. En el segundo capítulo se analizan estadísticamente los resultados logrados al estudiar comparativamente los fosfolípidos de los arenavirus mencionados y las células huéspedes enteras, infectadas con ellos o falsamente infectadas, indicándose cómo y por qué se aplica la metodología estadística elegida. El tercer capítulo se discute la puesta a punto y la e- lección de las distintas técnicas destinadas a separar y caracterizar membrana plasmática de retículo endoplásmico. En el cuarto capítulo se analizan los resultados obteni dos al separar y caracterizar membrana plasmática y retículo endoplásmico de células infectadas con el virus Junín y de las células no infectadas. En el quinto capítulo se analizan estadísticamente los resultados obtenidos al estudiar la composición fosfolipídica de la membrana plasmática y de retículo endoplásmico de las células infectadas con el virus Junín y de las células control no infectadas. Se analiza también la relación que existe entre los fosfolípidos virales y los de las distintas fraccio nes celulares. Finalmente se presenta una interpretación de los resultados obtenidos.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM).Facultad de Ciencias Exacta

Independent Lineage of Lymphocytic Choriomeningitis Virus in Wood Mice (Apodemus sylvaticus), Spain

To clarify the presence of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) in Spain, we examined blood and tissue specimens from 866 small mammals. LCMV RNA was detected in 3 of 694 wood mice (Apodemus sylvaticus). Phylogenetic analyses suggest that the strains constitute a new evolutionary lineage. LCMV antibodies were detected in 4 of 10 rodent species tested

Exploring IRES region accessibility by interference of foot-and-mouth disease virus infectivity

Translation initiation of picornavirus RNA is driven by an internal ribosome entry site (IRES) element located upstream of the initiator codon. RNA structure organization as well as RNA-protein interaction plays a fundamental role in internal initiation. IRES activity has been mainly analyzed in the context of reporter genes, lacking regions of the viral genome potentially affecting translation efficiency. With the aim to understand the vulnerability of the IRES and translation start region to small molecules in the context of the viral genome, we designed a set of customized RNase-resistant 2′O-methyl antisense oligoribonucleotides (2′OMe AONs) based on RNA structure data. These AONs were then used to monitor their capacity to interfere viral RNA translation, and thus, to inhibit virus yield. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) RNA translation can be initiated at two in-frame AUG codons. We show here that a 2′OMe AON complementary to AUG2 inhibited viral multiplication more efficiently than the one that targeted AUG1. Furthermore, the response of the viral RNA to AONs targeting the IRES region denoted important differences between tissue culture cells and cell-free systems, reinforcing the need to analyze viral RNA response in living cells. Importantly, we have identified four specific motifs within the IRES element that are targets for viral inhibitors both in tissue culture cells and in cell-free systems. The identified targets define accessible regions to small molecules, which disturb either the RNA structural organization or the RNA-protein interactions needed to initiate translation in FMDV RNA.Ministerio de Ciencia e Innovación (BFU2008-02159, CSD2009-00080, BFU2011-25437); Fundación Ramón ArecesPeer Reviewe

Characterization of a nuclear localization signal in the foot-and-mouth disease virus polymerase

We have experimentally tested whether the MRKTKLAPT sequence in FMDV 3D protein (residues 16 to 24) can act as a nuclear localization signal (NLS). Mutants with substitutions in two basic residues within this sequence, K18E and K20E, were generated. A decreased nuclear localization was observed in transiently expressed 3D and its precursor 3CD, suggesting a role of K18 and K20 in nuclear targeting. Fusion of MRKTKLAPT to the green fluorescence protein (GFP) increased the nuclear localization of GFP, which was not observed when GFP was fused to the 3D mutated sequences. These results indicate that the sequence MRKTKLAPT can be functionally considered as a NLS. When introduced in a FMDV full length RNA replacements K18E and K20E led to production of revertant viruses that replaced the acidic residues introduced (E) by K, suggesting that the presence of lysins at positions 18 and 20 of 3D is essential for virus multiplication. © 2013 Elsevier Inc.BIO2008-0447-C03-01 and BIO2011-24351; Fundación Ramón ArecesPeer Reviewe

Mutations that hamper dimerization of foot-and-mouth disease virus 3A protein are detrimental for infectivity

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) nonstructural protein 3A plays important roles in virus replication, virulence, and host range. In other picornaviruses, homodimerization of 3A has been shown to be relevant for its biological activity. In this work, FMDV 3A homodimerization was evidenced by an in situ protein fluorescent ligation assay. A molecular model of the FMDV 3A protein, derived from the nuclear magnetic resonance (NMR) structure of the poliovirus 3A protein, predicted a hydrophobic interface spanning residues 25 to 44 as the main determinant for 3A dimerization. Replacements L38E and L41E, involving charge acquisition at residues predicted to contribute to the hydrophobic interface, reduced the dimerization signal in the protein ligation assay and prevented the detection of dimer/multimer species in both transiently expressed 3A proteins and in synthetic peptides reproducing the N terminus of 3A. These replacements also led to production of infective viruses that replaced the acidic residues introduced (E) by nonpolar amino acids, indicating that preservation of the hydrophobic interface is essential for virus replication. Replacements that favored (Q44R) or impaired (Q44D) the polar interactions predicted between residues Q44 and D32 did not abolish dimer formation of transiently expressed 3A, indicating that these interactions are not critical for 3A dimerization. Nevertheless, while Q44R led to recovery of viruses that maintained the mutation, Q44D resulted in selection of infective viruses with substitution D44E with acidic charge but with structural features similar to those of the parental virus, suggesting that Q44 is involved in functions other than 3A dimerization. © 2012, American Society for Microbiology.Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN); Generalitat de Catalunya (SGR2009-0492); European Commission through grants FP7 HEALTH-F3-2009-223431 (EU project “Divinocell”) and FP7 HEALTH-2011-278603 (EU project “Dorian”); Fundación Ramón Areces; Centro de Computación Científica CCC-UAMPeer Reviewe

Discriminating Foot-and-Mouth Disease Virus-Infected and Vaccinated Animals by Use of β-Galactosidase Allosteric Biosensors▿ †

Recombinant β-galactosidases accommodating one or two different peptides from the foot-and-mouth disease virus (FMDV) nonstructural protein 3B per enzyme monomer showed a drastic enzymatic activity reduction, which mainly affected proteins with double insertions. Recombinant β-galactosidases were enzymatically reactivated by 3B-specific murine monoclonal and rabbit polyclonal antibodies. Interestingly, these recombinant β-galactosidases, particularly those including one copy of each of the two 3B sequences, were efficiently reactivated by sera from infected pigs. We found reaction conditions that allowed differentiation between sera of FMDV-infected pigs, cattle, and sheep and those of naïve and conventionally vaccinated animals. These FMDV infection-specific biosensors can provide an effective and versatile alternative for the serological distinction of FMDV-infected animals