Development of a reporter-based assay for the discovery of secondary metabolites in Actinobacteria

Pflanzen, Tiere und Mikroorgansimen stellen eine reiche Quelle für Sekundärmetaboliten dar. Viele dieser natürlichen Produkte, darunter Antibiotika, spielen in der Medizin neben anderen Bereichen wie zum Beispiel in der Landwirtschaft eine wichtige Rolle. Seit Alexander Flemings Entdeckung des Penicillins 1928 und dem später folgenden, sogenannten goldenen Zeitalter der Antibiotika Forschung und der erfolgreichen Anwendung vieler der dabei gefundenen Wirkstoffe in der Therapie von infektiösen Erkrankungen, ist es leider auch schon zu Resistenzbildungen von Mikroorgansimen gegen viele dieser Wirkstoffe gekommen. Um die schweren Folgen einer post- antibiotischen Ära, in der vormals leicht zu behandelnde Infektionen durch z.B. kleine Verletzungen und Wunden wieder zum Tod führen können, da Therapiemöglichkeiten, aufgrund der mangelnden Zahl an Arzneistoffen, fehlen, zu verhindern, gilt es den Fokus der Forschung vermehrt auf das Ziel der Entdeckung neuer Antibiotika zu richten. Durch die hohe Wiederfindungsrate von bioaktiven Substanzen aus terrestrischen Quellen und der hohen Biodiversität im Meer, wurde die Erforschung mariner Lebensräume interessanter. Gleichzeitig stehen mehr, schnellere und günstigere Methoden zur Sequenzierung von Genomen zur Verfügung und die daraus resultierende stetig steigende Anzahl sequenzierter Genome, die Dank der wiederum verbesserten bioinformatischen Methoden präziser analysiert werden können, zeigen, dass ein enormes, meist verborgenes Potential, in Form von viel mehr biosynthetischen Genclustern in Chromosomen von Mikroorganismen, vorhanden ist, sie die darin kodierten Produkte aber unter normalen Kulturbedingungen wegen mangelnder umweltbedingter Reize nicht produzieren. Um dieses Potential auszuschöpfen und Gencluster zu aktivieren, von denen vermutet wird, dass sie für die Bildung von unbekannten Komponenten verantwortlich sind, können verschiedene Methoden angewendet werden. In dieser Diplomarbeit wurde das Ziel der Entdeckung neuer natürlicher Substanzen, mit Hilfe rekombinanter DNA Technologie und eines damit konstruiertem Reporter Systems, verfolgt. Es wurden drei Streptomyces Stämme verwendet, die aus drei verschiedenen Schwämmen des Trondheim Fjords in Norwegen isoliert wurden. Mit Hilfe der Software antiSMASH wurde das Genom dieser Aktinobakterien auf das Vorhandensein von biosynthetischen Genclustern untersucht und jene Cluster ausgewählt, die für die Bildung von eher unbekannten Sekundärmetaboliten verantwortlich sind. Um die Aktivität von vermutlichen Promotor Regionen in diesen Clustern zu ermitteln, wurden zuerst Primer entworfen und die entsprechenden Promotor Regionen unter Verwendung dieser Primer mittels PCR hergestellt. Nach dem Einbau dieser Promotoren in Plasmide, die ein ebenfalls eingebautes Reportergen namens bpsA, das für die Produktion von Indigoidin verantwortlich ist, enthielten, wurden diese Vektoren durch Konjugation von E. coli in die Streptomyces Stämme überführt und die Aktivität der Promotor Regionen aufgrund der Farbänderung des Fermentationsmediums durch Expression von bpsA beobachtet. 5 Die Verwendung von verschiedenen Nährmedien zur Fermentation und die Anwendung eines Ethanol- Schocks sollten die inaktiven Promotoren aktivieren und diese Aktivierung und die eventuell daraus folgende Bildung von Sekundärmetaboliten mittels Reporter nachgewiesen werden. Aus Kulturmedien mit einer Farbänderung wurden Extrakte hergestellt, die mittels HPLC und HPLC-MS analysiert und mit Hilfe von Wachstumshemmungstests auf Bioaktivität überprüft wurden.Plants, animals and microorganisms are a rich source of natural products, namely secondary metabolites. Some of these natural products can be used as drugs for the treatment of diseases, e.g. antibiotics for infections. The discovery of new anti-infectives is necessary due to the growing number of resistant pathogens. Despite a lack of medical treatments caused by a reduced number of available antibiotics, the list of newly discovered compounds that can be used for such purposes is short. One problem is frequent rediscovery of already known compounds. However, new approaches can be used to find unknown bioactive compounds using genomics, next to common screening methods. Bioinformatics-guided analysis of genome sequences of some bacteria revealed a vast potential for secondary metabolite production. In bacteria the genes for secondary metabolite biosynthesis are often physically clustered together. Under standard laboratory conditions most of these clusters remain silent, so it is necessary to activate them for the production of potentially new compounds. Genetic manipulations by molecular biological methods and the use of different fermentation media can force the production of putative new substances. In this work, marine actinomycetes from the genus Streptomyces, which represent a rich source for bioactive secondary metabolites were used to discover new natural products. The draft genome sequences of three different strains isolated from three different sponges from Norwegian fjord were analyzed by a bioinformatics tool called antiSMASH. Different biosynthetic gene clusters, which have, according to the in-silico analysis, a higher chance to produce an unknown compound, were chosen for this project. Putative promoter regions of the genes, which are responsible for the building of scaffold structures of secondary metabolites, were amplified by PCR. Those PCR products were introduced into plasmids upstream of the reporter gene bpsA, a NRPS encoding for indigoidine-synthase, responsible for production of a blue pigment indigoidine. After the introduction of those vectors in the Streptomyces strains by conjugation from Escherichia coli, fermentations in different media were performed. The observation of a color-change in the media used for fermentation, with and without ethanol shock, and compared to a control, indicated the activity of the promoter region and thus, the activation of the cluster. The latter may suggest the production of secondary metabolites, some of which are maybe previously undetected compounds. Fermentation cultures with a visible color difference, compared to a control, were extracted. The extracts were tested for bioactivity by growth inhibition assays. HPLC and HPLC-MS analysis resulted in known and putative new substances, which are interesting for further analyzation

Icons. Windows on Eternity. Theology and Spirituality in Colour. Compiled by Gennadios Limouris. 1990

Haquin André. Icons. Windows on Eternity. Theology and Spirituality in Colour. Compiled by Gennadios Limouris. 1990. In: Revue théologique de Louvain, 22ᵉ année, fasc. 4, 1991. p. 545

Biosynthetic potential of the endophytic fungus Helotiales sp. BL73 revealed via compound identification and genome mining

Oberhofer M, Malfent F, Zehl M, et al. Biosynthetic potential of the endophytic fungus Helotiales sp. BL73 revealed via compound identification and genome mining. Applied and Environmental Microbiology . 2022: aem0251021.Endophytic fungi have been recognized as prolific producers of chemically diverse secondary metabolites. In this work, we describe a new representative of the order Helotiales isolated from the medicinal plant Bergenia pacumbis. Several bioactive secondary metabolites were produced by this Helotiales sp. BL 73 isolate grown on rice medium, including cochlioquinones and isofusidienols. Sequencing and analysis of the approx. 59 Mb genome revealed at least 77 secondary metabolite biosynthesis gene clusters, several of which could be associated with detected compounds or linked to previously reported molecules. Four terpene synthase genes identified in the BL73 genome were codon-optimized and expressed, together with farnesyl-, geranyl- and geranylgeranyl-pyrophosphate synthases, in Streptomyces spp. Analysis of recombinant strains revealed production of linalool and its oxidized form, terpenoids typically associated with plants, as well as a yet unidentified terpenoid. This study demonstrates the importance of a complex approach to the investigation of the biosynthetic potential of endophytic fungi using both conventional methods and genome mining. Importance Endophytic fungi represent as yet underexplored source of secondary metabolites, some of which may have industrial and medical applications. We isolated a slow-growing fungus belonging to the order Helotiales from the traditional medicinal plant Bergenia pacumbis and characterized its potential to biosynthesize secondary metabolites. We used both cultivation of the isolate with subsequent analysis of compounds produced, bioinformatics-based mining of the genome, and heterologous expression of several terpene synthase genes. Our study revealed enormous potential of this Helotiales isolate to produce structurally diverse natural products, including polyketides, non-ribosomally synthesized peptides, terpenoids and RiPPs. Identification of meroterpenoids and xanthones, along with establishing a link between these molecules and their putative biosynthetic genes sets a stage for investigation of the respective biosynthetic pathways. Heterologous production of terpenoids suggests that this approach can be used for the discovery of new compounds belonging to this chemical class using Streptomyces bacteria as hosts