Nitric Oxide Synthase inhibition counteracts the stress-induced DNA methyltransferase 3b expression in the hippocampus of rats

It has been postulated that the activation of NMDA receptors (NMDAr) and nitric oxide (NO) production in the hippocampus is involved in the behavioral consequences of stress. Stress triggers NMDAr-induced calcium influx in limbic areas, such as the hippocampus, which in turn activates neuronal NO synthase (nNOS). Inhibition of nNOS or NMDAr activity can prevent stress-induced effects in animal models, but the molecular mechanisms behind this effect are still unclear. In this study, cultured hippocampal neurons treated with NMDA or dexamethasone showed an increased of DNA methyltransferase 3b (DNMT3b) mRNA expression, which was blocked by pre-treatment with nNOS inhibitor n(omega)-propyl-l-arginine (NPA). In rats submitted to the Learned Helplessness paradigm (LH), we observed that inescapable stress increased DNMT3b mRNA expression at 1h and 24h in the hippocampus. The NOS inhibitors 7-NI and aminoguanidine (AMG) decreased the number of escape failures in LH and counteracted the changes in hippocampal DNMT3b mRNA induced in this behavioral paradigm. Altogether, our data suggest that NO produced in response to NMDAr activation following stress upregulates DNMT3b in the hippocampus.Peer reviewe

Avalia??o da participa??o de canais de c?lcio voltagem-dependentes sobre a resposta pruritog?nica em camundongos

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 455926.pdf: 1580649 bytes, checksum: 43ccab4db0f539ea4361b47f57d0cedd (MD5) Previous issue date: 2014-01-24We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3.3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Phα1β. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Phα1β remained for up to 12 h. MVIIA or Phα1β also prevented the itching elicited by intradermal (i.d.) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Phα1β markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine. Notably, spinal MVIIA or Phα1β greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Phα1β did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Phα1β prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus.Foram avaliados os efeitos da inibi??o farmacol?gica dos canais de c?lcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administra??o intratecal (i.t.) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3.3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) n?o alterou o comportamento de co?ar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na regi?o dorsal do pesco?o de camundongos. Entretanto, o comportamento de co?ar induzido pela tripsina foi significativamente diminu?do pela administra??o i.t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Phα1β). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplica??o de tripsina. Por outro lado, a toxina Phα1β derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada at? 12 h antes da tripsina. O pr?-tratamento com MVIIA ou Phα1β foi efetivo em inibir o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o intrad?rmica (i.d.) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas n?o inibiram o comportamento de co?ar induzido pela inje??o i.d. de H2O2. A co-inje??o de MVIIA ou Phα1β inibiu o comportamento de co?ar induzido pela aplica??o i.t. do pept?deo liberador de gastrina (GRP), mas n?o inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administra??o i.t. da toxina MVIIA ou Phα1β inibiu a coceira cr?nica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritog?nica de ambas as toxinas n?o parece estar relacionada com a modula??o do processo inflamat?rio na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Phα1β n?o foram capazes de inibir o edema e a migra??o de neutr?filos induzidos pela aplica??o i.d. de tripsina. A aplica??o i.t. de MVIIA ou Phα1β n?o modificou a express?o do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a express?o de c-Fos aos n?veis do grupo controle, de acordo com a avalia??o na medula dos camundongos. Finalmente, a incuba??o de MVIIA ou Phα1β preveniu o influxo de c?lcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinaliza??o da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como poss?veis estrat?gias para o tratamento do prurido, especialmente nas condi??es onde h? aus?ncia de resposta ? terapia atual

Role of nitric oxide in stress-induced DNA methylation

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse.Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress

Avaliação da participação de canais de cálcio voltagem-dependentes sobre a resposta pruritogênica em camundongos

Foram avaliados os efeitos da inibição farmacológica dos canais de cálcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administração intratecal (i. t. ) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3. 3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) não alterou o comportamento de coçar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na região dorsal do pescoço de camundongos. Entretanto, o comportamento de coçar induzido pela tripsina foi significativamente diminuído pela administração i. t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Phα1β). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplicação de tripsina. Por outro lado, a toxina Phα1β derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada até 12 h antes da tripsina.O pré-tratamento com MVIIA ou Phα1β foi efetivo em inibir o comportamento de coçar induzido pela aplicação intradérmica (i. d. ) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas não inibiram o comportamento de coçar induzido pela injeção i. d. de H2O2. A co-injeção de MVIIA ou Phα1β inibiu o comportamento de coçar induzido pela aplicação i. t. do peptídeo liberador de gastrina (GRP), mas não inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administração i. t. da toxina MVIIA ou Phα1β inibiu a coceira crônica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritogênica de ambas as toxinas não parece estar relacionada com a modulação do processo inflamatório na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Phα1β não foram capazes de inibir o edema e a migração de neutrófilos induzidos pela aplicação i. d. de tripsina.A aplicação i. t. de MVIIA ou Phα1β não modificou a expressão do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a expressão de c-Fos aos níveis do grupo controle, de acordo com a avaliação na medula dos camundongos. Finalmente, a incubação de MVIIA ou Phα1β preveniu o influxo de cálcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinalização da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como possíveis estratégias para o tratamento do prurido, especialmente nas condições onde há ausência de resposta à terapia atual.We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3. 3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Phα1β. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Phα1β remained for up to 12 h. MVIIA or Phα1β also prevented the itching elicited by intradermal (i. d. ) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Phα1β markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine.Notably, spinal MVIIA or Phα1β greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Phα1β did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Phα1β prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus

The Interaction between Circulating Cell-Free Mitochondrial DNA and Inflammatory Cytokines in Predicting Human Mental Health Issue Risk in Adolescents: An Explorative Study.

Adolescence is often a challenging time in which psychiatric issues have a strong connection to mental health disorders later in life. The early identification of the problems can reduce the burden of disease. To date, the effective identification of adolescents at risk of developing mental health problems remains understudied. Altogether, the interaction between circulating cell-free mtDNA (ccf-mtDNA) and inflammatory cytokines in adolescents is insufficiently understood regarding experienced mental health difficulties. Our study selected the participants based on the Strength and Difficulty Questionnaire (SDQ) score using the cut-off points of 3 and 18 for the low and the high score groups, respectively. The answers of the SDQ at the age of 12.2-15.7 years contributed to the investigation of (i) whether ccf-mtDNA units are associated with cytokines, and (ii) if an interaction model for predicting risk of mental health issues is observed. We discovered a sex-specific correlation between the screened markers associated with mental health problems in the low and high SDQ score groups among the male participants and in the low SDQ score group among the female participants. The mitochondrial MT-ND4 and MT-CO1 genes correlated significantly with interleukin-12p70 (IL-12p70) in males and with monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in females. Due to the nature of the explorative study, the studied markers alone did not indicate statistical significance for the prediction of mental health problems. Our analysis provided new insight into potential plasma-based biomarkers to predict mental health issues

Proteomic insights into mental health status: plasma markers in young adults

Abstract Global emphasis on enhancing prevention and treatment strategies necessitates an increased understanding of the biological mechanisms of psychopathology. Plasma proteomics is a powerful tool that has been applied in the context of specific mental disorders for biomarker identification. The p-factor, also known as the “general psychopathology factor”, is a concept in psychopathology suggesting that there is a common underlying factor that contributes to the development of various forms of mental disorders. It has been proposed that the p-factor can be used to understand the overall mental health status of an individual. Here, we aimed to discover plasma proteins associated with the p-factor in 775 young adults in the FinnTwin12 cohort. Using liquid chromatography–tandem mass spectrometry, 13 proteins with a significant connection with the p-factor were identified, 8 of which were linked to epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling. This exploratory study provides new insight into biological alterations associated with mental health status in young adults