Oxidation and glycoxidation of phosphatidylserine and their effect in immune response : a lipidomic approach

Doutoramento em BioquímicaPhosphatidylserine (PS) is a member of the class of phospholipids, and is distributed among all cells of mammalians, playing important roles in diverse biological processes, including blood clotting and apoptosis. When externalized, PS is a ligand that is recognized on apoptotic cells. It has been considered that before externalization PS is oxidized and oxPS enhance the recognition by macrophages receptors, however the knowledge about oxidation of PS is still limited. PS, like others phospholipids, has two fatty acyl chains and one polar head group, in this case is the amino acid serine. The modifications in PS structure can occur by oxidation of the unsaturated fatty acyl chains and by glycation of the polar head group, due to free amine group, thus increasing the susceptibility to oxidative events. The main goal of this work was to characterize and identify oxidized and glycoxidized PS, contributing to the knowledge of the biological role of oxidation products of PS, as well as of glycated PS, in immune and inflammatory processes. To achieve this goal, PS standards (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho- L-serine (POPS), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DPPS), 1- palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (PLPS) and 1-palmitoyl-2- arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (PAPS)) and glycated PS (PAPS and POPS) were induced to oxidize in model systems, using different oxidant reagents: HO• and 2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride (AAPH) . The detailed structural characterization of the oxidative products was performed by ESI-MS and MS/MS coupled to separation techniques such as off line TLC-MS and on line LC-MS, in order to obtained better characterization of the larger number of PS and glycated PS oxidation products. The results obtained in this work allowed to identify several oxidation products of PS and glycated PS with modifications in unsaturated fatty acyl chain. Also, oxidation products formed due to structural changes in the serine polar head with formation of terminal acetamide, terminal hydroperoxyacetaldehyde.and terminal acetic acid (glycerophosphacetic acid, GPAA) were identified. The mass spectrometric specific fragmentation pathway of each type of oxidation product was determined using different mass spectrometry approaches. Based on the identified fragmentation pathways, targeted lipidomic analysis was performed to detect oxidation products modified in serine polar head in HaCaT cell line treated with AAPH. The GPAA was detected in HaCaT cells treated with AAPH to induce oxidative stress, thus confirming that modifications in PS polar head is possible to occur in biological systems. Furthermore, it was found that glycated PS species are more prone to oxidative modifications when compared with non glycated PS. During oxidation of glycated PS, besides the oxidation in acyl chains, new oxidation products due to oxidation of the glucose moiety were identified, including PS advanced glycation end products (PSAGES). To investigate if UVA oxidative stress exerted changes in the lipidome of melanoma cell lines, particularly in PS profile, a lipidomic analysis was performed. The lipid profile was obtained using HILIC-LC-MS and GC-MS analysis of the total lipid extracts obtained from human melanoma cell line (SKMEL- 28) after UVA irradiation at 0, 2 and 24 hours. The results did not showed significant differences in PS content. At molecular level, only PS (18:0:18:1) decreased at the moment of irradiation. The most significant changes in phospholipids content occurred in phosphatidylcholines (PC) and phosphatidylinositol (PI) classes, with an increase of mono-unsaturated fatty acid (MUFA), similarly as observed for the fatty acid analysis. Overall, these data indicate that the observed membrane lipid changes associated with lipogenesis after UVA exposure may be correlated with malignant transformations associated with cancer development and progression. Despite of UVA radiation is associated with oxidative damage, in this work was not possible observe oxidation phospholipids. The anti/pro-inflammatory properties of the oxidized PLPS (oxPLPS) versus non-oxidized PLPS were tested on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages. The modulation of intracellular signaling pathways such as NF-kB and MAPK cascades by oxPLPS and PS was also examined in this study. The results obtained from evaluation of anti/pro-inflammatory properties showed that neither PLPS or oxPLPS species activated the macrophages. Moreover only oxidized PLS were found to significantly inhibit NO production and iNOS and il1β gene transcription induced by LPS. The analysis at molecular level showed that this was the result of the attenuation of LPS-induced c-Jun-N-terminal kinase (JNK) and p65 NF-kB nuclear translocation. Overall these data suggest that oxPLPS, but not native PLPS, mitigates pro-inflammatory signaling in macrophages, contributing to containment of inflammation during apoptotic cell engulfment. The results obtained in this work provides new information on the modifications of PS, facilitating the identification of oxidized species in complex samples, namely under physiopathologic conditions and also contributes to a better understanding of the role of oxPS and PS in the inflammatory response, in the apoptotic process and other biological functions.A fosfatidilserina (PS) é um fosfolípido que se encontra em todas as células de mamíferos e desempenha um papel importante em processos biológicos, tais como, a coagulação sanguínea e a apoptose. A externalização da PS em células apoptóticas é reconhecida pelos recetores dos macrófagos, sendo uma via de sinalização essencial para a eliminação destas células. Nos últimos anos, tem sido proposto que a externalização da PS pode estar associada oxidação, e que a PS oxidada (oxPS) parece ser mais facilmente reconhecida pelos macrófagos do que a PS não oxidada. No entanto as modificações geradas pela oxidação da PS, assim como os seus efeitos biológicos são ainda pouco conhecidas. A PS, tal como outros fosfolípidos, pode ser facilmente oxidada em especial quando tem na sua composição ácidos gordos polinsaturados. Por outro lado, o grupo amina livre do aminoácido serina do grupo polar da PS pode sofrer glicação por reação com o grupo carbonilo da glucose, aumentando assim a sua suscetibilidade à oxidação. O principal objetivo deste trabalho foi caracterizar e identificar produtos de oxidação e glicação de PS e desta forma contribuir para a compreensão do seu papel biológico especialmente na resposta imune e inflamatória. Para alcançar o objetivo proposto, procedeu-se à oxidação da PS. Para este fim, foram selecionados compostos modelo de PS com diferentes composições de ácidos gordos: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS); 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DPPS); 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero- 3-fosfo-L-serina (PLPS) e 1-palmitoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (PAPS). De modo a completar o estudo procedeu-se também à oxidação da PAPS e POPS glicadas. As reações de oxidação foram realizadas em sistemas modelo usando diferentes reagentes oxidantes: HO• e dicloridrato de 2,2’-azo-bis- (2-amidinopropano) (AAPH). A caracterização estrutural detalhada dos produtos obtidos nas diversas reações foi realizada por espectrometria de massa (MS) com ionização por electrospray (ESI) ESI-MS e por espectrometria se massa tandem (MS/MS) acoplada a técnicas de separação como cromatografia de camada fina (TLC) (off-line TLC-MS) e cromatografia líquida (LC) (on line LC-MS). Os resultados obtidos neste trabalho permitiram identificação dos vários produtos de oxidação de PS e PS glicada, observando-se modificações na cadeia acilo insaturada. Observaram-se também produtos de oxidação formados devido a alterações estruturais no grupo polar com formação de produtos com terminais: acetamida, hidroperoxiacetaldeido e ácido acético (ácido glicerofosfoacetico, GPAA). A caracterização por MS/MS permitiu identificar as vias de fragmentação específicas de cada tipo de produto de oxidação. Com base nas vias de fragmentação identificadas anteriormente, foi realizada uma análise de lipidómica direcionada “targeted lipidomic” para detetar os produtos resultantes da oxidação do grupo polar da PS em queratinócitos HaCaT tratados com AAPH, como estímulo de stress oxidativo. Com esta abordagem direcionada foi possível detetar derivados GPAA nos extratos lipídicos obtidos destas células HaCaT, confirmando a possibilidade de oxidação de cabeça de PS em sistemas biológicos. Os estudos de oxidação de PS glicadas mostraram que as PS glicadas oxidam mais facilmente que as suas congéneres não glicadas. Durante a oxidação de PS glicada, além da oxidação nas cadeias acilo foram identificadas novos produtos de oxidação devido a degradação oxidativa na molécula de glucose ligada á PS, identificados como PS-AGES (do inglês, PS- Advanced glycation end products). Com o objetivo de investigar o efeito da radiação UVA na membrana fosfolipídica e, em particular, no perfil de fosfatidilserinas, foi realizado um estudo com linhas celulares de melanoma (SK-MEL-28). Após a exposição à radiação UVA das linhas SK-MEL-28, os extratos lipídicos foram analisados por LC-MS e MS/MS e GC-MS. Os resultados não revelaram diferenças significativas no teor de PS após a exposição. A nível molecular, apenas a PS (18:0/18:1) diminuiu no momento da irradiação, sugerindo algum dano oxidativo, mas que foi revertido nos tempos seguintes. As mudanças mais significativas no teor de fosfolípidos ocorreram nas classes da fosfatidilcolina e fosfatidilinositol, observando-se um aumento da concentração relativa de ácidos gordos monoinsaturados (MUFA). As alterações observadas nos lípidos parecem estar relacionadas com a lipogénese e com desenvolvimento e progressão do cancro. Curiosamente, apesar do UVA estar associado ao dano oxidativo, não foi possível observar neste estudo a presença fosfolípidos oxidados. Para o estudo das propriedades anti- e pró-inflamatórias da PLPS oxidada (oxPLPS) e PLPS não oxidados foi avaliada a produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos na presença e na ausência do estímulo inflamatório, o lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados obtidos mostraram que não houve alteração na produção de NO em macrófagos estimulados com PS e oxPS na ausência de LPS. Por outro lado observou-se que no caso de macrófagos estimulados com LPS, o oxPLPS inibiu significativamente a produção de NO induzida por LPS, enquanto que o PLPS não mostrou qualquer efeito significativo. A nível molecular, observou-se que a diminuição de NO foi mediada pela inibição da fosforilação da c-Jun-N-terminal quinase (JNK) e na translocação nuclear do p65 NF-kB. Em geral estes dados sugerem que oxPLPS, mas não PLPS, reduz a sinalização pró-inflamatória em macrófagos, contribuindo para a contenção de inflamação durante apoptose celular. Os resultados obtidos nesta dissertação fornecem nova informação sobre as modificações da PS, facilitando a sua identificação em amostras complexas, nomeadamente em condições fisiopatológicas e também, informação que permite uma melhor compreensão sobre o papel da oxPS e PS na resposta inflamatória, no processo de apoptose e em outras funções biológicas

Identification of oxidation products of cardiolipin using mass spectrometry

Mestrado em Métodos BiomolecularesCardiolipina (CL) é um fosfolípido de estrutura complexa, que se encontra quase exclusivamente na membrana interna da mitocôndria, onde se encontra associada a diferentes complexos da cadeia respiratória. Pela sua localização, este fosfolípido desempenha um importante papel no metabolismo energético mitocôndrial. Alterações na cardiolipina nomeadamente por modificações oxidativas têm sido relacionadas com a apoptose celular e com várias condições patológicas, particularmente nas doenças neurodegenerativas. A estrutura da CL apresenta quatro cadeias de ácidos gordos que podem diversificar no comprimento e no grau de insaturação, é muito susceptível a danos oxidativos por espécies reactivas de oxigénio (ROS). A sua localização, na mitocôndria aumenta a probabilidade desta sofrer oxidação, uma vez que existe uma considerável produção de ROS na membrana interna mitocôndrial. ROS estão envolvidas no stress oxidativo em diferentes biomoleculas, nomeadamente nos lípidos, levando a modificações na sua estrutura e consequentemente, à perda da sua função. Apesar da importância da oxidação da CL e das suas possíveis consequências biológicas, existe um conhecimento limitado em relação aos produtos de oxidação formados em condições de stress oxidativo. Neste estudo, a espectrometria de massa e a espectrometria de massa acoplada à cromatografia liquida (LC-ESI-MS) foram utilizados para identificar modificações oxidativas especificas da etra-linoleoil CL induzidas pelo radical hidroxilo através da reacção de Fenton (H2O2 and Fe2+). Os resultados obtidos neste estudo permitiram identificar pela primeira vez diversos produtos de oxidação de cadeia curta e também outros de cadeia longa durante a oxidação da CL. Os produtos de oxidação de cadeia curta resultam de uma clivagem do ácido gordo oxidado, conduzindo á formação de ácido gordos de cadeia curta com terminal aldeído, e ácidos dicarboxilico, observados em MS na forma de iões [M-H]- e [M-2H]2-. Estes resultados permitiram detectar alguns destes produtos de oxidação na mitocôndria dos rins dos ratos tratados com gentamicina, com nefropatia confirmada. A identificação detalhada da fragmentação dos produtos de cadeia longa por LC-MS/MS permitiu a diferenciação de isómeros, e a identificação do local de oxidação para CL com 2, 4, 6 e 8 átomos de oxigénios. Este trabalho permitiu identificação de iões produto específicos que permitem a sua atribuição inequívoca, que será fundamental para a identificação destas espécies em amostras biológicas. ABSTRACT: Cardiolipin (CL) is a phospholipid with a complex structure, found almost exclusively in the inner mitochondrial membrane, where it is found associated with several different complexes of the respiratory chain. Because of its localization, this phospholipid performs an important role in the mitocôndrial energetic metabolism. Alteration of CL namely by oxidative modifications has been related with various pathological conditions, particularly in neurodegenerative diseases. CL structure bears four chains of fatty acids that can diversify in length and degree of unsaturation; it is susceptible to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS). Their location, in the mitochondria, makes them even more likely to be oxidized, since that there is a considerable production of ROS in the inner mitochondrial membrane. ROS are involved in oxidative stress modifications of different biomolecules, namely lipids, leading to changes in their structure and in consequence, loss of their function. In spite of the importance of CL oxidation and it biological consequence, there is a limited knowledge of the oxidation products of CL formed under oxidative stress. In this study, mass spectrometry and mass spectrometry coupled with liquid chromatography (LC-MS) was used to identify the specific oxidative modifications of tetra-linoleoyl CL induced by the hydroxyl radical generated under Fenton reaction conditions (H2O2 and Fe2+). The results obtained with this study allowed us to identify, for the first time, several short chain oxidation products along with some long chain products during the oxidation of CL. Short-chain oxidation products resulted from a cleavage of the oxidized fatty acid, leading to the formation of short chain fatty acids with aldehyde terminal, and dicarboxylic acids, observed in MS in the form of the ions [M-H]- and [M- 2H]2-. These results allowed us to detect some of these oxidation products in the mitochondria of kidneys obtained from rats treated with gentamicin, with confirmed nephropathy. The detailed identification of the fragmentation of the long chain products by LC-MS/MS allowed us to differentiate isomers, and the identification of the oxidation location for the CL with 2, 4, 6 and 8 oxygen atoms. This work allowed the identification of specific product ions which allow their unequivocal assignment that will be paramount for the identification of these species in biological samples

Lipidomic signature of Bacillus licheniformis I89 during the different growth phases unravelled by high-resolution liquid chromatography-mass spectrometry

Bacillus licheniformis I89 is a non-pathogenic, Gram-positive bacterium, frequently found in soil. It has several biotechnological applications as producer of valuable compounds such as proteases, amylases, surfactants, and lantibiotics. Herein, it is reported the identification of the polar lipidome of B. licheniformis I89 during the different growth phases (lag, exponential and stationary) at 37 °C. The analytical approach relied on hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry (HILIC-ESI-MS), accurate mass measurements and tandem mass spectrometry (MS/MS). In the lipidome of B. licheniformis I89 were identified four phospholipid classes: phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, lysyl-phosphatidylglycerol, and cardiolipin; two glycolipid classes: monoglycosyldiacylglycerol and diglycosyldiacylglycerol; and two phosphoglyceroglycolipid classes: mono-alanylated lipoteichoic acid primer and lipoteichoic acid primer. The same lipid species were identified at the different growth phases, but there were significant differences on the relative abundance of some molecular species. There was a significant increase in the 30:0 lipid species and a significant decrease in the 32:0 lipid species, between exponential and stationary phases, when compared to lag phase. No differences were observed between exponential and stationary phases. The lipidomic-based approach used herein is a very promising tool to be employed in the study of bacterial lipid composition, which is a requirement to understand its metabolism and response to growth conditions.publishe

Halophyte plants from sustainable marine aquaponics are a valuable source of omega-3 polar lipids

Marine aquaponics is a promising sustainable approach for the production of profitable crops such as halophytes. However, the effect of this culture approach on the lipid composition of halophytes remains unknown. In this work, we contrasted the polar lipidome of Salicornia ramosissima and Halimione portulacoides when produced in marine aquaponics (effluent from a super-intensive flatfish aquaculture production), with that of conspecifics from donor wild populations. Phospholipids and glycolipids were identified and quantified by LC-MS and MS/MS and their profile statistically analysed. Halophytes produced in aquaponics have higher levels of glycolipids with n-3 fatty acids (DGDG 36:3; SQDG 36:3; MGDG 36:6) compared with the donor wild populations. In the case of H. portulacoides, a significant increase of phospholipids bearing n-3 fatty acids (most in PC and PE) was also recorded. These lipids have potential applications in food, feed and pharmaceutical industries, contributing to the valorization of halophytes produced under sustainable aquaculture practices.publishe

A PEDAGOGIA FREIREANA E A EJA NA EDUCAÇÃO DOS SUJEITOS PRIVADOS DE LIBERDADE: POSSIBILIDADES E ENTRAVES

A presente discussão busca, através de uma investigação bibliográfica, as influências da pedagogia de Paulo Freire na Educação de Jovens e Adultos, considerando os aspectos pertinentes da Pedagogia de Freire, corroborando para a educação daqueles que estão privados de liberdade. Assim, aponta-se a educação a partir da pedagogia freireana, como um meio de reinserção social, promoção da autonomia, emancipação e reinserção social do sujeito aprisionado. Busca ainda, contemplar a educação nas prisões como uma prática para a liberdade, para além das grades, para a vida e convivência em sociedade. &nbsp

A condição da mulher privada de liberdade: um estudo de caso a partir da vivência de uma egressa da cadeia pública de Guarapuava

A presente investigação busca, por meio de um estudo de caso realizado com uma egressa da Cadeia Pública de Guarapuava, no estado do Paraná, compreender as relações de poder, violação de direitos e a condição da mulher privada de liberdade. O estudo proposto teve como instrumento uma entrevista com roteiro semiestruturado de discussões aplicado a uma egressa da Cadeia Pública de Guarapuava, selecionada a partir de uma aproximação feita no ano de 2019. O intuito foi apontar os anseios vivenciados pelas mulheres nas unidades prisionais e suas considerações frente às disposições impostas pelo encarceramento. Dadas as premissas da problemática, considera-se a educação como um instrumento para promoção da autonomia da mulher presa na luta pela garantia dos direitos

A PEDAGOGIA FREIREANA E A EJA NA EDUCAÇÃO DOS SUJEITOS PRIVADOS DE LIBERDADE: POSSIBILIDADES E ENTRAVES

A presente discussão busca, através de uma investigação bibliográfica, as influências da pedagogia de Paulo Freire na Educação de Jovens e Adultos, considerando os aspectos pertinentes da Pedagogia de Freire, corroborando para a educação daqueles que estão privados de liberdade. Assim, aponta-se a educação a partir da pedagogia freireana, como um meio de reinserção social, promoção da autonomia, emancipação e reinserção social do sujeito aprisionado. Busca ainda, contemplar a educação nas prisões como uma prática para a liberdade, para além das grades, para a vida e convivência em sociedade. &nbsp

A PEDAGOGIA FREIREANA E A EJA NA EDUCAÇÃO DOS SUJEITOS PRIVADOS DE LIBERDADE: possibilidades e entraves

A presente discussão busca, através de uma investigação bibliográfica, as influências da pedagogia de Paulo Freire na Educação de Jovens e Adultos, considerando os aspectos pertinentes da Pedagogia de Freire, corroborando para a educação daqueles que estão privados de liberdade. Assim, aponta-se a educação a partir da pedagogia freireana, como um meio de reinserção social, promoção da autonomia, emancipação e reinserção social do sujeito aprisionado. Busca ainda, contemplar a educação nas prisões como uma prática para a liberdade, para além das grades, para a vida e convivência em sociedade

Unravelling the fatty acid profiles of different polychaete species cultured under integrated multi-trophic aquaculture (IMTA)

[Abstract] Polychaetes can be successfully employed to recover otherwise wasted nutrients present in particulate organic matter (POM) of aquaculture effluents. The present study describes the fatty acid (FA) profile of four different polychaete species cultured in sand filters supplied with effluent water from a marine fish farm. The FA profile of cultured and wild Hediste diversicolor was compared and revealed a ≈ 24.2% dissimilarity, with cultured biomass displaying a higher content in two essential n-3 highly unsaturated FA (HUFA) (EPA [20:5 n-3] and DHA [22:6 n-3]—eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid, respectively). The comparison of the FA profile of cultured H. diversicolor with that of other polychaete species whose larvae successfully settled on the sand filters (Diopatra neapolitana, Sabella cf. pavonina and Terebella lapidaria) revealed that their FA profile, which is here described for the first time, displayed high levels of EPA and DHA (≈ 1.5–4.8 and 1.0–1.1 µg mg−1 DW, respectively). The highest concentration of total FA per biomass of polychaete was recorded in H. diversicolor and T. lapidaria, with both species being the ones whose FA profiles revealed a lowest level of dissimilarity and more closely resembled that of the aquafeed used in the fish farm. In the present work it was demonstrated that it is possible to produce polychaetes biomass with high nutritional value through an eco-design concept such as integrated multi-trophic aquaculture (IMTA). Indeed, this framework promotes a cleaner production and, in this specific case, allowed to recover essential fatty acids that are commonly wasted in aquaculture effluents.European Commission; MAR-02.01.01-FEAMP-0038European Commission; Centro-01-0145-FEDER-000018Portugal. Fundação para a Ciência e a Tecnologia; PD/BD/127989/2016Portugal. Centro de Estudos do Ambiente e do Mar; UIDB/50017/2020Portugal. Centro de Estudos do Ambiente e do Mar; UIDP/50017/202