Alterações em componentes inibitórios ao longo do neurodesenvolvimento : efeitos preventivos do resveratrol em modelo animal de TEA

O transtorno do espectro autista (TEA) é uma desordem multifatorial complexa cuja fisiopatologia ainda não é completamente compreendida. Entretanto, algumas características, como as alterações nos componentes inibitórios encefálicos, se evidenciam nessa desordem. Dentre os principais fatores de risco ambientais para o TEA se destaca a exposição ao ácido valproico (VPA) durante a gestação, de forma que se utilizou o modelo animal baseado nessa abordagem para a obtenção dos dados experimentais. No Capítulo I, realizou-se um compilado de dados da literatura sobre o papel de fatores de transcrição (FTs) em diferentes desordens do neurodesenvolvimento; além disso, foram feitas análises, utilizando ferramentas de bioinformática, dos principais locais de expressão, bem como dos momentos de pico de expressão e das possíveis rotas de interação entre os FTs, incluindo os possíveis prejuízos induzidos pelo VPA. Essa análise contribuiu para a identificação de diversas hipóteses que poderiam estar associadas com danos observados na vida pós-natal. Sabendo-se que o VPA possui características pró-inflamatórias e pró-oxidantes, o resveratrol (RSV), polifenol com características anti-inflamatórias, antioxidantes e neuroprotetoras, surge como uma estratégia interessante de contraposição dessas características, viabilizando um estudo importante de vias envolvidas no TEA. No Capítulo II, foi possível observar que o VPA induziu vastas alterações na composição neuronal do córtex pré-frontal medial (CPFm) e, em menor escala, no hipocampo (HC), além de reduzir a expressão de receptor GABAA e das proteínas sinápticas neuroliguina-2 e gefirina. O tratamento com RSV foi capaz de prevenir, de forma geral, as alterações em neurônios totais e interneurônios GABAérgicos (IGs) no CPFm, porém não no HC. Além disso, o RSV também teve um efeito similar ao VPA na expressão de proteínas sinápticas no CPFm. Análises de bancos de dados de modelos animais em idade embrionária ressaltam alterações na maquinaria transcricional, metabolismo de carboidratos, metabolismo mitocondrial e ciclo celular, via da WNT, via da NOTCH e outros, sugerindo, junto ao Capítulo I, hipóteses referentes às ações do VPA e do RSV. No Capítulo III, foi observada uma expansão do dano hipocampal induzida pela exposição ao VPA, com descontinuidade do giro denteado e descompactação de CA1, além de alterações disseminadas na composição neuronal em todas as sub-regiões do HC. O RSV preveniu a alteração morfológica, além de equilibrar diversos parâmetros associados a IGs e neurônios totais. A exposição ao VPA induziu alterações na expressão de PTEN, AKT e CK2, não prevenidas por RSV. A partir destes dados, conclui-se que a exposição ao VPA pode desencadear alterações em etapas iniciais do desenvolvimento embrionário, com consequentes alterações pós-natais. Em animais jovens, foram observadas alterações em IGs, sinapses e receptor GABAA. Em animais adultos, o HC se destaca como uma região fortemente alterada, indicando um provável agravamento ao longo da vida. É provável que a ação preventiva do RSV ocorra por oposição ao VPA em vias de regulação da transcrição, metabolismo e outras, conforme apontam os Capítulos I e II. Dessa forma, observa-se que uma intervenção precoce é capaz de mudar o panorama de evolução da desordem, abrindo horizontes para estudos de novas abordagens no TEA.Autism spectrum disorder (ASD) is a complex multifactorial disorder whose pathophysiology is not yet fully understood. However, some characteristics, such as changes in brain inhibitory components, emerge in this disorder. Among the main environmental risk factors for ASD, exposure to valproic acid (VPA) during pregnancy stands out, so the animal model based on this approach was used to obtain the experimental data. In Chapter I, a compilation of data from the literature on the role of transcription factors (TFs) in different neurodevelopmental disorders was carried out, in addition, analyzes were conducted, using bioinformatics tools, of the main sites of expression, as well as the moments of peak expression and possible routes of interaction among TFs, including possible damage induced by VPA. This analysis contributed to the identification of several hypotheses that could be associated with the damage observed in postnatal life. Knowing that VPA has pro-inflammatory and pro-oxidant characteristics, resveratrol (RSV), a polyphenol with anti-inflammatory, antioxidant, and neuroprotective characteristics, appears as an interesting strategy to counteract these characteristics, enabling an important study of the pathways involved in ASD. In Chapter II, it was possible to observe that VPA induced vast changes in the neuronal composition of the medial prefrontal cortex (mPFC) and, to a lesser extent, in the hippocampus (HC), in addition to reducing the expression of GABAA receptor and synaptic proteins neuroligin-2 and gephyrin. Treatment with RSV was able to generally prevent changes in total neurons and GABAergic interneurons (GIs) in mPFC, but not in the HC. Furthermore, RSV also had a similar effect to VPA on the expression of synaptic proteins in the mPFC. Database analyzes of animal models at embryonic age highlight changes in transcriptional machinery, carbohydrate metabolism, mitochondrial metabolism, cell cycle, WNT pathway, NOTCH pathway, and others, suggesting, together with Chapter I, hypotheses regarding the actions of VPA and the RSV. In Chapter III, an expansion of the hippocampal damage induced by exposure to VPA was observed, with discontinuity of the dentate gyrus and decompaction of the CA1, in addition to widespread changes in neuronal composition in all HC subregions. RSV prevented the morphological change, in addition to balancing several parameters associated with IGs and total neurons. Exposure to VPA induced changes in the expression of PTEN, AKT and CK2, not prevented by RSV. From these data, it is concluded that exposure to VPA can trigger changes in early stages of embryonic development, with consequent postnatal changes. In young animals, changes were observed in GIs, synapses, and GABAA receptor. In adult animals, the HC stands out as a strongly altered region, indicating a probable worsening throughout life. It is likely that the preventive action of RSV occurs in opposition to VPA in transcriptional, metabolic, and other regulatory pathways, as indicated in Chapters I and II. In this way, it is observed that an early intervention can change the course of the disorder, opening horizons for studies of new approaches in ASD

Resveratrol prevents cytoarchitectural and interneuronal alterations in the valproic acid rat model of autism

Autism spectrum disorder (ASD) is a prevalent neurodevelopmental disorder characterized by several alterations, including disorganized brain cytoarchitecture and excitatory/inhibitory (E/I) imbalance. We aimed to analyze aspects associated with the inhibitory components in ASD, using bioinformatics to develop notions about embryonic life and tissue analysis for postnatal life. We analyzed microarray and RNAseq datasets of embryos from different ASD models, demonstrating that regions involved in neuronal development are affected. We evaluated the effect of prenatal treatment with resveratrol (RSV) on the neuronal organization and quantity of parvalbumin-positive (PV+), somatostatin-positive (SOM+), and calbindin-positive (CB+) GABAergic interneurons, besides the levels of synaptic proteins and GABA receptors in the medial prefrontal cortex (mPFC) and hippocampus (HC) of the ASD model induced by valproic acid (VPA). VPA increased the total number of neurons in the mPFC, while it reduced the number of SOM+ neurons, as well as the proportion of SOM+, PV+, and CB+ neurons (subregion-specific manner), with preventive effects of RSV. In summary, metabolic alterations or gene expression impairments could be induced by VPA, leading to extensive damage in the late developmental stages. By contrast, due to its antioxidant, neuroprotective, and opposite action on histone properties, RSV may avoid damages induced by VPA

ATLANTIC-PRIMATES: a dataset of communities and occurrences of primates in the Atlantic Forests of South America

Primates play an important role in ecosystem functioning and offer critical insights into human evolution, biology, behavior, and emerging infectious diseases. There are 26 primate species in the Atlantic Forests of South America, 19 of them endemic. We compiled a dataset of 5,472 georeferenced locations of 26 native and 1 introduced primate species, as hybrids in the genera Callithrix and Alouatta. The dataset includes 700 primate communities, 8,121 single species occurrences and 714 estimates of primate population sizes, covering most natural forest types of the tropical and subtropical Atlantic Forest of Brazil, Paraguay and Argentina and some other biomes. On average, primate communities of the Atlantic Forest harbor 2 ± 1 species (range = 1–6). However, about 40% of primate communities contain only one species. Alouatta guariba (N = 2,188 records) and Sapajus nigritus (N = 1,127) were the species with the most records. Callicebus barbarabrownae (N = 35), Leontopithecus caissara (N = 38), and Sapajus libidinosus (N = 41) were the species with the least records. Recorded primate densities varied from 0.004 individuals/km 2 (Alouatta guariba at Fragmento do Bugre, Paraná, Brazil) to 400 individuals/km 2 (Alouatta caraya in Santiago, Rio Grande do Sul, Brazil). Our dataset reflects disparity between the numerous primate census conducted in the Atlantic Forest, in contrast to the scarcity of estimates of population sizes and densities. With these data, researchers can develop different macroecological and regional level studies, focusing on communities, populations, species co-occurrence and distribution patterns. Moreover, the data can also be used to assess the consequences of fragmentation, defaunation, and disease outbreaks on different ecological processes, such as trophic cascades, species invasion or extinction, and community dynamics. There are no copyright restrictions. Please cite this Data Paper when the data are used in publications. We also request that researchers and teachers inform us of how they are using the data. © 2018 by the The Authors. Ecology © 2018 The Ecological Society of Americ

Análise de neurônios gabaérgicos parvalbumina-positivos em áreas sensoriais no modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao ácido valproico

O Transtorno do Espectro Autista é uma desordem do neurodesenvolvimento caracterizada, segundo o DSM-V, por uma díade comportamental: déficits de comunicação e interação social além de comportamentos repetitivos ou estereotipados. Outro aspecto de extrema importância para o transtorno são as alterações sensoriais presentes em mais de 90% dos indivíduos, tais como hiperresponsividades a estímulos não nocivos (visuais, táteis, auditivos) e hiporresponsividade a estímulos nocivos, que implicam em prejuízo na qualidade de vida. Apesar da etiologia do autismo não ser conhecida, tanto fatores genéticos quanto ambientais já foram associados à desordem, incluindo a utilização de ácido valproico (VPA) durante a gestação – situação que aumenta significativamente a chance do desenvolvimento de autismo nos filhos. Baseado nessas observações, desenvolveu-se um modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao VPA, validado pela identificação de diversas características (comportamentais, morfológicas e moleculares) do tipo autista. No presente trabalho, realizou-se uma análise quantitativa e organizacional de interneurônios GABAérgicos positivos para parvalbumina em regiões associadas com processamento sensorial – Área Somatossensorial Primária (ASSP) e Região da Amígdala (RAM). A obtenção dos animais passou por um processo inicial de acasalamentos, onde a verificação da fecundação foi comprovada através da identificação de espermatozoides no líquido vaginal na manhã posterior ao pareamento. As fêmeas do grupo VPA foram induzidas com uma injeção intraperitoneal de VPA (600mg/kg) no E12,5. Filhotes machos com 30 dias foram anestesiados e perfundidos com paraformaldeído 4% para promover a fixação tecidual, após a eutanásia relizou-se a remoção do encéfalo, posteriormente preservado em Tissue-Tek® a -80ºC. O tecido foi cortado em criostato e as fatias contendo as estruturas de interesse foram identificadas através do atlas Paxinos. Realizou-se imunofluorescência com objetivo de obter três marcações: DAPI, NeuN e Parvalbumina (PV). As imagens foram obtidas por microscopia confocal e processadas no software ImageJ com o plug—in Cell Counter. A análise estatística foi realizada no software Graph Pad Prims 5, utilizando o Teste t de Student seguido de correção de Welch, considerando p<0,05 como significativo. Na ASSP o grupo VPA exibiu, além de severa desorganização laminar, redução significativa na quantidade de células não-neuronais na camada IV-V (1,26x), demonstrando um prejuízo em células gliais, essenciais para a manutenção da homeostase local, além disso, a quantidade e a densidade de neurônios PVpositivos também demonstraram redução significativa na camada IV-V (3,06x), enquanto na camada II-III (1,69x) houve um aumento significativo. Complementarmente, a análise de todas as camadas em conjunto não apresentou diferenças significativas para nesses parâmetros, demonstrando uma possível alteração na migração desses interneurônios entre as camadas corticais. Na Região da Amígdala, houve redução significativa do número e densidade de interneurônios PV+ no grupo VPA (2,66x) Considerando os dados apresentados, nós demonstramos pela primeira vez que a exposição pré-natal ao VPA induziu importantes alterações nas camadas corticais da ASSP e na RAM no que se refere a células não neuronais e neurônios inibitórios PV+. Esses prejuízos no componente inibitório provavelmente resultam em expressivas consequências no balanço excitatório/inibitório que poderiam explicar diversas alterações comportamentais identificadas.Autism Spectrum Disorder is a neurodevelopmental disorder characterized, according to DSM-5, by a behavioral dyad: impairments in communication and social interaction in addition to repetitive or stereotyped behaviors. Another extremely important aspect for ASD are the sensory alterations present in more than 90% of the individuals with ASD like hyper-responsiveness to non-harmful stimuli (visual, tactile and auditory) and hypo-responsiveness to harmful stimuli, which implies a great loss in life quality. Although etiology is not known, both genetic and environmental factors have been associated with the disorder, including the use of valproic acid during pregnancy – situation that significantly increases the chances of autism development in the children. Based on these observations, an animal model of autism by prenatal exposure to valproic was developed and validated by the findings (behavioral, molecular and morphological) of several autistic-like characteristics. In the present study, a quantitative and organizational analysis of parvalbumin-positive GABAergic interneurons was carried out in sensory processing related regions – Primary Somatosensory Area and Amygdala Region. Obtaining the animals underwent an initial process of mating, in which the fecundation check was confirmed by the presence of spermatozoa in vaginal smear in the morning after pairing. The female were separated and the VPA group received a intraperitoneal injection of VPA (600m/kg) in E12.5. The 30 days old male pups were anesthetized and transcardiacally perfused with paraformaldehyde 4% to promote tissue fixation, after euthanasia the brain was removed and preserved in Tissue-Tek® at -80ºC. The tissue was sliced in cryostat at -20ºC and the slices containing the structures of interest were identified through Paxinos atlas. Immunofluorescence was made in order to identify three markers: DAPI, NeuN and Parvalbumin (PV). The images were obtained by confocal microscopy and processed in ImageJ software with Cell Counter plug-in. Statistical analysis realized in Graph Pad Prism 5 software, using Student's T test followed by Welch's Correction and considering p<0.05 as significant. In Primary Somatosensory Area, VPA group exhibited, besides severe laminar disorganization, significant reduction in non-neuronal cells in layer IV-V (1,26x), demonstrating impairment in glial cells, essential for maintaining local homeostasis, moreover, the quantity and density of PV-positive neurons also showed significant reduction in layer IV-V (3,06x), while in layer II-III (1,69x) was a significant increase. In addition to this, the analysis of all layers together didn't exhibited significant differences for PV+ quantity and density, demonstrating a possible alteration in the migration of these interneurons between the cortical layers. In Amygdala Region, the number and density of PV+ interneurons were significant reduced (2,66x) in VPA group. Considering the present data we demonstrated for the first time that prenatal exposure to VPA induced important alteration in PSSA cortical layers regarding to non-neuronal and inhibitory PV neurons. These impairments in the inhibitory component, probably have expressive consequences in the excitatory/inhibitory balance which may explain some behavioral alteration