GENOME EDITING: PROPELLING THE NEXT GENERATION OF CROP IMPROVEMENT

Climate change and population size records threaten food security. Therefore, the call for a more sustainable and efficient crop production has never been more urgent. Traditional plant breeding was one of the first successful approaches to expand cultivation areas and crop yield. Later, biotechnological tools, such as genetically modified organisms containing exogenous DNA, further broadened the limits of agricultural results, yet bringing huge financial, bureaucratic, and public rejection hurdles. In the 90s, scientific advances brought the opportunity to drive mutations using engineered nucleases and since 2013, CRISPR-Cas has emerged as the most practical toolkit to edit genomes. One of the most striking possibilities is to generate edited and non-transgenic plants. In this review, we present the working mechanism of CRISPR-induced mutations, pinpoint the latest techniques developed, as well as its myriad of applications in agriculture. The enhancing scope of CRISPR ranges from introducing traits of agronomic interest – such as herbicide resistance, resistance/tolerance to biotic and abiotic stresses, and quality and durability of products – to accelerating plant breeding processes, including haploid induction, generating male-sterile lines, fixating hybrid vigor, and overcoming self-incompatibility. We also discuss regulatory issues surrounding edited plants and derived products around the world, challenges that must be overcome, and future prospects to harness all the potential of this amazing tool to guarantee the new crop production revolution.As mudanças climáticas e números recordes de população ameaçam a segurança alimentar. Portanto, o apelo por uma produção agrícola mais sustentável e eficiente nunca foi tão urgente. O melhoramento genético tradicional foi uma das primeiras abordagens bem-sucedidas para expandir as áreas de cultivo e o rendimento das safras. Posteriormente, ferramentas biotecnológicas, como organismos geneticamente modificados contendo DNA exógeno, ampliaram ainda mais os limites dos resultados agrícolas, apesar de ainda trazer enormes obstáculos financeiros, burocráticos e de rejeição pública. Na década de 90, os avanços científicos trouxeram a oportunidade de conduzir mutações usando nucleases projetadas e, desde 2013, CRISPR-Cas surgiu como o kit de ferramentas mais prático para editar genomas. Uma das possibilidades mais marcantes é gerar plantas editadas e não transgênicas. Nesta revisão, apresentamos o mecanismo de trabalho das mutações induzidas por CRISPR, identificando as últimas técnicas desenvolvidas, bem como sua miríade de aplicações na agricultura. O escopo de aprimoramento do CRISPR varia desde introduzir características de interesse agronômico – como resistência a herbicidas, resistência/tolerância a estresses bióticos e abióticos e qualidade e durabilidade de produtos – até acelerar processos de melhoramento genético de plantas, incluindo indução de haploidia, geração de linhagens macho-estéreis, fixação de vigor híbrido e superação da autoincompatibilidade. Também discutimos questões regulatórias em torno de plantas editadas e produtos derivados mundialmente, desafios que devem ser superados e perspectivas futuras para aproveitar todo o potencial desta ferramenta incrível para garantir a nova revolução na produção de culturas agrícolas

CRISPR-transient expression in soybean for simplified gRNA screening in planta

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método para criar e validar sistemas CRISPR-Cas e diferentes gRNAs em embriões de soja (Glycine max). Dois genes modelo foram usados para mutação simples com um gRNA ou deleção parcial do gene com dois guias. Os gRNAs foram inseridos nos vetores de transformação CRISPR por uma enzima de restrição do tipo IIS ou por subclonagem e inserção do promotor + gRNA2 no vetor de transformação final, com uso do método clássico de clonagem por enzimas de restrição. Os vetores foram construídos com sucesso para um e dois gRNAs. A transformação transiente de soja por Agrobacterium foi realizada para testar a qualidade dos gRNAs e do próprio sistema (cassete de expressão). Detectaram-se mutação simples e deleção gênica nos embriões transformados após o enriquecimento do DNA por digestão seguida de reação em cadeia da polimerase e sequenciamento, o que indica que o sistema CRISPR-Cas e os guias estavam funcionando. Este protocolo pode ser usado para acelerar as estratégias de edição de genoma baseadas em CRISPR, para transformação genética em soja.The objective of this work was to develop a method to create and validate CRISPR-Cas systems and different gRNAs in soybean (Glycine max) embryos. Two model genes were used for simple mutation with one gRNA or partial gene deletion with two guides. The gRNAs were inserted into the CRISPR transformation vectors by a type IIS restriction enzyme or by subcloning and inserting the promoter + gRNA2 in the final transformation vector using the classic restriction enzyme cloning method. The vectors were successfully constructed for one and two gRNAs. Agrobacterium-mediated transient transformation in soybean was carried out to test the quality of gRNAs and of the system itself (expression cassette). Simple mutation and gene deletion were detected in the embryos transformed after DNA enrichment by enzyme digestion followed by polymerase chain reaction and sequencing, which indicates that the CRISPR-Cas system and guides were working. This protocol can be used to accelerate CRISPR-based genome editing strategies for genetic transformation in soybean

Análise de transcriptoma de experimentos de RNA- Seq com e sem repetições biológicas: revisão.

The discovery of nucleic acids opened new frontiers of knowledge, enablingresearchers to access an enormous amount of data, through large-scale sequencing methodologiesand bioinformatics tools. Amongst these new possibilities, RNA-Seq has been used to identify andquantify RNA molecules. To obtain more accurate biological responses from RNA-Seq data somequestions should be considered such as experimental design, type ofsynthesized library, size ofthefragments generated, number ofbiological replicates, depth, and coverage ofthe sequencing, speciesgenome availability and, the choice of software to properly perform the computational analyzes.Accurate bioinformatics analyzes allow the selection ofgenes with a lower error rate, increasing thevalidation assertiveness via RT-qPCR and thus, reducing costs. The objective of this review was topresent the analysis stages of RNA-Seq data, from experimental design to systems biology,considering relevant points, as well as to pointed out some software currently available to carry theseanalyzes out. Besides, with this review, we aimed to help the academic community to understand allsteps and biases involved in RNA-Seq data analysis, from experiments with or without biologicalreplicates.A descoberta de ácidos nucléicos abriu novas fronteiras de conhecimento, permitindoque os pesquisadores acessassem uma enorme quantidade de dados, através de metodologias desequenciamento em larga escala e ferramentas de bioinformática. Entre essas novas possibilidades,o RNA-Seq (sequenciamento de RNA) tem sido usado para identificar e quantificar moléculas deRNA. Para obter respostas biológicas mais precisas a partir dos dados de RNA-Seq, algumasquestões devem ser consideradas, como o desenho experimental, o tipo de biblioteca sintetizada, otamanho dos fragmentos gerados, o número de repetições biológicas, a profundidade e cobertura dosequenciamento, a disponibilidade do genoma da espécie e, a escolha dos softwares para executaradequadamente as análises computacionais. Análises bioinformáticas precisas permitem a seleçãode genes com menor taxa de erro, aumentando a assertividade da validação via RT-qPCR e, assim,reduzindo custos. O objetivo desta revisão foi apresentar as etapas de análise de dados de RNA-Seq,desde o projeto experimental até a biologia dos sistemas, considerando pontos relevantes, bemcomo apontar alguns softwares atualmente disponíveis para realizar essas análises. Além disso, comesta revisão, objetivamos ajudar a comunidade acadêmica a compreender todas as etapas e viesesenvolvidos na análise de dados de RNA-Seq, a partir de experimentos com ou sem réplicasbiológicas

Tolerância à seca em cultivares-elite de soja com a introgressão do transgene AtAREB1

The objective of this work was to verify if the introgression of the AtAREB1 gene in the 'LS93-0375' and 'BMX Desafio RR' elite soybean germplasms increases the tolerance of these plants to water deficit. The F4 progenies of these two elite cultivars and of the AtAREB1 transgenic line (BR16-AtAREB1) and its background ('BR16') were subjected to water deficit assays. The water deficit bioassays were performed in a greenhouse using the following six soybean lines: the genetically modified BR16-AtAREB1 and its background 'BR16'; 'LS93' and its F4 progeny, LS93-AtAREB1; and 'BMX Desafio RR' and its F4 progeny, Desafio-AtAREB1. A randomized complete block experimental design was carried out in a 6x2 factorial arrangement, with  the six soybean genotypes and two water conditions – control (C) and water deficit (WD) treatments – with nine replicates. Soybean genotypes containing the AtAREB1 gene showed better physiological performances under drought stress and altered expressions of drought-responsive genes. The intogression of AtAREB1 in soybean increases the plant drought tolerance, regardless of the genetic background in which the gene was introduced.O objetivo deste trabalho foi verificar se a introgressão do gene AtAREB1 em dois germoplasmas-elite de soja, 'LS93-0375' e 'BMX Desafio RR', aumenta a tolerância dessas plantas ao deficit hídrico. As progênies F4 das duas cultivares-elite e da linhagem transgênica AtAREB1 (BR16-AtAREB1) e de seu background ('BR16') foram submetidas a deficit hídrico. Os bioensaios de deficit hídrico foram realizados em casa de vegetação, tendo-se utilizado as seis seguintes linhagens de soja: a geneticamente modificada BR16-AtAREB1 e seu background 'BR16'; 'LS93' e sua progênie F4, LS93-AtAREB1; e 'BMX Desafio RR' e sua progênie F4, Desafio-AtAREB1. Utilizou-se delineamento experimental de blocos completos com tratamentos casualizados, em arranjo fatorial 6x2, com os seis genótipos de soja e duas condições hídricas – controle (C) e tratamentos de deficit hídrico (WD) –, com nove repetições. Os genótipos de soja que contêm o gene AtAREB1 exibiram melhor desempenho fisiológico sob estresse hídrico e expressão alterada de genes responsivos à seca. A introgressão de AtAREB1 na soja aumenta a tolerância à seca, independentemente do background genético em que o gene foi introduzido

Uso múltiplo dos recursos naturais renováveis da fazenda Experimental de Iguatemi

Trabalho apresentado no 31º SEURS - Seminário de Extensão Universitária da Região Sul, realizado em Florianópolis, SC, no período de 04 a 07 de agosto de 2013 - Universidade Federal de Santa Catarina.A Universidade Estadual de Maringá possui a Fazenda Experimental de Iguatemi, onde o projeto é desenvolvido com o objetivo de utilizar a natureza para divulgar a biodiversidade e incentivar preservação dos recursos naturais. Inicialmente, os visitantes são recepcionados no centro de visitantes, onde assistem a um filme que dá início à discussão dos temas relacionados às questões ambientais. Em seguida, conduzidos pelos monitores, os visitantes são levados a percorrer trilhas, nas quais estabelecem íntimo contato com a natureza. A maioria do público que participa das visitas são alunos do ensino fundamental e médio, tanto de instituições públicas quanto privadas. As visitas também estão abertas para alunos de nível superior, técnicos, grupos da 3ª idade e grupos de pessoas com necessidades especiais. Como resultado, espera-se que os monitores cumpram as diversas ações em termos de ensino, pesquisa e extensão, além de enfatizar o trabalho em equipe, permitindo a cada um o exercício de administrar as adversidades e o aprimoramento das suas habilidades individuais. Em relação aos visitantes, sua participação contribui para a evolução dos conceitos de cidadania, permitindo a cada um a compreensão e o exercício das complexas relações pessoais e com o meio ambiente

Gene silencing of Diaphorina citri Kuwayama by RNA interference

O aumento da incidência da doença huanglonbing (HLB) nos pomares brasileiros tem contribuído significativamente para o aumento do custo de produção de laranja no Brasil, devido à suscetibilidade de todas as variedades cultivadas. O HLB é associado às bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus e Candidatus Liberibacter americanus, transmitidas pelos psilídeos Diaphorina citri e Trioza erytreae. No Brasil, o inseto vetor responsável pela rápida disseminação da doença é o psilídeo Diaphorina citri. Os principais métodos de controle do HLB são a eliminação de plantas sintomáticas, uso de mudas sadias e controle do vetor. O uso de plantas geneticamente modificadas pode ser uma alternativa ao uso excessivo de inseticidas para controle do inseto vetor. Sendo assim, pode-se adotar uma nova tecnologia que se baseia no uso de RNAs de interferência (RNAi) para o silenciamento de genes específicos do inseto vetor. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do silenciamento dos genes calreticulina (DcCRT), lacase (DcLAC) e Snf7 (DcSNF7) de Diaphorina citri por RNA de interferência via alimentação em folhas destacadas de Murraya paniculata que absorveram solução contendo dsRNA de silenciamento. A princípio, foi avaliada a expressão dos genes candidatos em diferentes estádios fenológicos dos insetos. Em seguida, foram realizados bioensaios de sobrevivência e silenciamento, com as doses 0, 5, 25 e 50µg de dsRNA. A sobrevivência dos insetos foi avaliada ao longo de 144 horas, enquanto que os insetos utilizados na análise de expressão gênica foram coletados 12, 24, 48, 72 e 96h após o início da alimentação. Para os genes DcCRT, relacionado à quelatização de íons cálcio, e DcLAC, relacionado à gelificação oxidativa do estilete, ambos envolvidos no processo alimentar do inseto, também foi observado o efeito das doses de dsRNA na quantidade de alimento ingerido, 120h após o início da alimentação. Além disso, também foi realizado bioensaio com dsRNA Cy3-labbled, para verificar a distribuição do dsRNA absorvido. A expressão dos genes candidatos, de modo geral, se manteve uniforme ao longo dos estádios de desenvolvimento dos insetos, exceto para o gene DcLAC que apresentou maior expressão em adultos recém emergidos do que nos demais estádios avaliados. Nos bioensaios com dsRNA de silenciamento, observou-se fenótipo letal apenas com o silenciamento do gene DcSnf7, 144 horas após o início da alimentação. Durante o período avaliado, foi constatada redução na expressão gênica apenas de DcCRT, após 12h de alimentação e DcLAC após 96h de alimentação com seus respectivos dsRNA de silenciamento. Além disso, a dose de 5µg de dsRNA foi suficiente para causar tal efeito de silenciamento gênico. No bioensaio para quantificação da alimentação, observou- se redução na excreção de aminoácidos nos insetos alimentados com 5µg de dsRNA, em ambos os genes candidatos (DcCRT e DcLAC) 120h após o início da alimentação. Adicionalmente, a análise de distribuição de dsRNA pela folha mostrou que há absorção do dsRNA pela folha destacada, permitindo a alimentação pelo inseto. Dessa forma, conclui-se que os genes estudados apresentam potencial para o controle do psilídeo Diaphorina citri, via silenciamento gênico por RNAi.The increase in the incidence of huanglonbing disease (HLB) in Brazilian orchards has contributed to increase of orange production costs in Brazil, due to the susceptibility of all cultivated variety of orange. HLB is associated with the Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter africanus and Candidatus Liberibacter americanus bacteria, transmitted by the psyllids Diaphorina citri and Trioza erytreae. In Brazil, the insect vector responsible for the rapid spread of the disease is Diaphorina citri. The most important methods of HLB control are the elimination of symptomatic plants, the use of healthy nursery trees, and vector control. The use of genetically modified plants may be an alternative to the excessive use of insecticides to control the insect vector. Therefore, a new technology based on using RNAs of interference (RNAi), for silencing specific genes of the insect vector can be used. Thus, the aim of this work was to evaluate the effect of silencing calreticulin (DcCRT), laccase (DcLAC) and Snf7 (DcSNF7) genes in Diaphorina citri by interference RNA through feeding in leaves of Murraya paniculata that absorbed a solution containing dsRNA of silencing. At first, the expression of the candidate genes in different phenological stages of the insects was evaluated. Survival and silencing bioassays were then performed at doses of 0, 5, 25 and 50 µg of dsRNA. Insect survival was evaluated over 144 hours, while the insects used in gene expression analysis were collected 12, 24, 48, 72 and 96 hours after feeding. For the DcCRT genes, associated to the calcium ion chelation, and DcLAC, related to the oxidative gelling of the stylet, both involved in the insect feed process, the effect of the doses of dsRNA on the amount of food ingested, 120h after the beginning of feeding was observed. In addition, a bioassay with Cy3-labbled dsRNA was also performed to verify the distribution of absorbed dsRNA. The expression of the candidate genes generally remained uniform throughout the stages of insect development, except for the DcLAC gene that showed greater expression in newly emerged adults than in the other evaluated stages. In the bioassays with dsRNA for gene silencing, a lethal phenotype was observed only with the silencing of the DcSnf7 gene, 144 hours after the beginning of feeding. During the evaluated period, there was a reduction in the gene expression only of DcCRT, after 12h of feed and DcLAC after 96h of feeding with their respective silencing dsRNA. Additionally, the dose of 5µg of dsRNA was enough to cause this gene silencing effect. In the bioassay for feeding quantification, a reduction in amino acid excretion was observed in insects fed with 5 µg of dsRNA, in both candidate genes (DcCRT and DcLAC) 120 h after the beginning of feeding. In addition, the analysis of dsRNA distribution by the leaf showed that there is absorption of the dsRNA by the detached leaf, allowing feeding by the insect. Thus, we conclude that the genes studied have potential for the control of the psyllid Diaphorina citri, through gene silencing mediated by RNAi

Interference of different rootstocks in grapevine \'Niagara Rosada\' development

O conhecimento da interferência do porta-enxerto no desenvolvimento da copa é muito importante, pois tais interações para cada combinação porta-enxerto e cultivar copa adotada pode variar. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência dos porta-enxertos \'IAC 766\', \'IAC 572\', \'IAC 313\', \'IAC 571-6\' e \'Ripária do Traviú\', no desenvolvimento e fertilidade das gemas da cultivar copa \'Niagara Rosada\'. O estudo foi realizado em videira \'Niagara Rosada\' conduzida sob o sistema de espaldeira, na região de Jundiaí - SP. As avaliações foram realizadas em três ciclos de produção, destes, dois foram realizados no ciclo tradicional, em que a poda de produção é realizada no inverno e a colheita no fim da primavera e início de verão, e um foi realizado na denominada safrinha, em que a poda de produção ocorre no verão e a colheita no fim do outono e início do inverno. Para os ciclos de produção tradicionais avaliou-se a fertilidade da primeira até a quarta ou quinta gema, o número de brotação, o número de cacho e o comprimento final dos ramos em 2014 e 2015. No ciclo de produção safrinha avaliou-se a fertilidade da quinta até a oitava gema e os demais dados biométricos durante o cultivo. Nesse ciclo de produção avaliou-se a produção e qualidade de frutos da videira. O delineamento experimental adotado foi em blocos casualizados em esquema de parcela subdividida para fertilidade de gemas, e em blocos casualizados para as demais variáveis. Os dados coletados foram submetidos à análise de variância, e quando significativo, os dados foram submetidos ao teste de comparação de médias Tukey a 0,05 de probabilidade. Não foi observado efeito dos diferentes porta-enxertos na fertilidade de gemas, no desenvolvimento da planta, na produção e qualidade dos frutos de videira \'Niagara Rosada\'.The knowledge about rootstock interference in scion development is important, because these interactions can vary with the combination of rootstock and scion. Thus, the aim of this study was to analyze the interaction of the rootstocks \'IAC 766\', \'IAC 572\', \'IAC 313\', \'IAC 571-6\' e \'Ripária do Traviú\' to the development and bud fruitfulness of \'Niagara Rosada\' scion. This study was conducted in \'Niagara Rosada\' training by espalier system in Jundiaí - SP region. The experiment was performed in three crop seasons, two called traditional season, when the pruning is done in winter and the harvest in the end of spring and beginning of summer, and one non-traditional crop season, when pruning is performed in summer and the harvest in the end of fall or beginning of winter. In traditional crop season was evaluated the fruitfulness from first to fourth or fifth bud, the budburst, the number of cluster and the shoot length in 2014 and 2015. In non-traditional crop season was evaluated fruitfulness from fifth from eighth bud, likewise the biometric data. Furthermore, in this crop season was evaluated the yield and fruit quality of grapevine \'Niagara Rosada\'. The statistical design t was randomized blocks in split plot for fruitulness, and randomized blocks for the other trials. The data was submitted to analysis of variance, and the means were compared to Tukey test at 0,05 of probability. There was no effect of rootstock on fruitfulness, development of plant, yield and fruit quality of grape \'Niagara Rosada\'

Rootstock on production and quality of ‘Niagara Rosada’ grapevine

Abtract In Brazil, the producers have changed used rootstocks to get more vigor to scion. Rootstocks change the distribution of bud fruitfulness over grapevine shoots and the expression of the bud fruitfulness into fruit yield. Hence, these modification could alter ideal pruning length. In this way, it was evaluated bud fruitfulness, fruit yield and quality of ‘Niagara Rosada’ grapevine grafted onto rootstocks: ‘IAC 766’, ‘IAC 572’, ‘IAC 313’, ‘IAC 571-6’, and ‘Riparia do Traviu’, which ‘IAC 766’ is the most used rootstock in São Paulo State, nowadays. The evaluations were performed over three crop seasons, in a vineyard located in Louveira, SP. Two evaluations were performed in Brazilian traditional season, and one crop pruning was performed in Brazilian summer, called “off-season”. In traditional seasons, the bud fruitfulness was evaluated from the first to fourth bud in 2014 and to the fifth in 2015. In the off-season, bud fruitfulness was evaluated from the fifth to eighth bud. Fruit yield and quality were also evaluated over the three production cycles. Bud fruitfulness of ‘Niagara Rosada’ grafted onto the evaluated rootstocks showed that this characteristic was more affected by the environmental conditions, confirmed due to alteration of bud fruitfulness through production cycles. Additionally, no effect of rootstock was observed on fruit yield, and quality of ‘Niagara Rosada’. Only isolated variations were detected, and these are not enough to confirm the influence of rootstocks on scion of ‘Niagara Rosada’. Although no effect of rootstocks on bud fruitfulness, fruit yield and quality has been observed in the evaluated conditions, all rootstocks are recommended to be used in combination with ‘Niagara Rosada’