Caracterização fisico-quimica e biologica de proteinas isoladas de sementes de leguminosas : lectinas e inibidores de proteinases

Orientador: Sergio MarangoniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As leguminosas contêm quantidades relativamente grandes de proteínas e dentre essas proteínas destacam-se os inibidores de proteinases e lectinas. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito de inibidores de proteinases sobre o desenvolvimento da Diatraea saccharalis e sobre microrganismos fitopatogênicos, assim como caracterizar físico-quimicamente uma lectina de Crota/aria paulina e estudar suas propriedades biológicas. A lectina das sementes de Crota/aria paulina foi purificada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE Sepharose Fast Flow e em cromatografia de fase reversa-HPLC. A massa molecular determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras e não redutoras foi calculada em aproximadamente 30 kDa. A hemaglutinação induzida por CrpL sobre eritrócitos humanos e bovinos é inibida por N-acetil-D-galactosamina, D-galactose e pela glicoproteína asialofetuína. A lectina não requer íons divalentes para sua atividade, pois não é inibida por EDT A. A análise do conteúdo de carboidrato para CrpL indicou que esta lectina contém aproximadamente 6,2% de carboidratos, utilizando galactose e manose como padrões, o que comprova que esta lectina é uma glicoproteína. A composição global de aminoácido mostrou que a lectina é rica em resíduos de aminoácidos prolina, glicina, serina e alanina, e não apresenta resíduos de histidina, arginina, metionina e fenilalanina. A seqüência N-terminal apresentou-se bloqueada e os poucos resíduos obtidos não mostraram qualquer homologia com outras lectinas da família leguminosa. Estudos de agregação plaquetária induzida por ADP com plasma humano até a concentração de 100ug/ml de CrpL, demonstraram não haver modulação significativa sobre plaquetas. O estudo envolvendo CrpL sobre bactérias Xanthomonas campestris pv. phaseoli e Xanthomonas campestris pv. passiflorae, demonstrou que esta lectina afetou o crescimento dessas bactérias. As propriedades antimetabólicas dos inibidores de proteinases (IPs) de soja e feijão, foram determinadas "in vivo" após a incorporação em dieta artificial, com avaliação do potencial de crescimento de populações da broca-da-cana Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae). Os inibidores foram incorporados em dieta artificial à base de farelo de soja e levedura de canade-açúcar. O efeito dos inibidores sobre o desenvolvimento das lagartas de D. saccharalis foi avaliado aos 16 dias de idade para os diferentes tratamentos (T1, T2 e T3), através da viabilidade larval; % de eficiência de lagartas aptas; peso das lagartas e peso de pupas com 24 horas. Os inibidores de tripsina de soja e de feijão atrasaram o desenvolvimento das lagartas, além de interferir no peso. Foram analisados também, os inibidores de CpTI, CjTI, CsTI, SBTI e PvTI sobre o crescimento micelial de fungos do gênero Fusarium e Colletotrichum. Os experimentos foram conduzidos sobre placas de Petri, usando meio de BDA para Fusarium sp e meio de aveia para o Coletotrichum, com 10 repetições. Como controle foi usada água esterilizada. As placas foram deixadas á 28°C no escuro. Quando o controle alcançou o diâmetro total da placa, o experimento foi interrompido. Os inibidores mostraram diferentes efeitos sobre o crescimento de Fusarium s p "in vitro". O CpTI não mostrou qualquer efeito em relação ao controle, e o PvTI não teve efeito fungicida mas reduziu a concentração de hifas. Inibidor de CjTI foi capaz de ocasionar mudanças na morfologia do fungo. CjTI and PvTI mostrou efeito fungistático sobre o crescimento de Colletotrichum graminicola, sendo que o inibidor PvTI mostrou-se mais eficaz no controle do crescimento micelial. O SBTI não foi efetivo contra quaisquer espécies de fungos estudados. Estudos envolvendo CpTI e PvTI sobre a germinação de esporos de fungos da espécie Ustilago scitaminia, demonstrou que esses inibidores não têm efeitos sobre esses fungos. Inibidores de CpTI foram capazes de inibir o crescimento de duas espécies de bactérias, assim como BvcTI foi capaz de inibir o crescimento de Xanthomonas sp da cana de açúcar. PvTI não mostrou efeito sobre essas bactérias. Os resultados obtidos sugerem que CrpL, assim como os inibidores de proteinases estudados de várias sementes de leguminosas, podem estar envolvidos no mecanismo de defesa contra microrganismos fitopatogênicos. Os resultados com inibidores de serinoproteinases, de feijão e soja, sugerem, também, a possibilidade desses inibidores serem utilizados como ferramentas no estudo de plantas transgênicas de cana-de-açúcar no controle da broca (Diatraea saccharalis)Abstract: A naturaly occuring lectin activity was detected in the extract of Crota/aria paulina seeds. The crude lectin extract was prepared by grounding the seeds followed by acid extraction with glycine 0.1 M I NaCI 0.15 buffer, pH 2.6. The lectin from C. paulina was purified by ion-exchange and reverse fase chromatography. The lectin purified was assayed with human (A, S, AS, O) and animal (Cow) erythrocytes and it was nonspecific for any human blood group. This lectin agglutinated native and trypsintreated erythrocytes and it requires no Ca++ or Mg++ for hemagglutination activity. Hemagglutinating inhibitory assay was performed with mono and disaccharides solution (100mM) and it was inhibited by N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose and byasialofetuin. Studies performed in SDS-PAGE (12,5%) of purified lectin under non-reducing and reducing conditions showed a single band of 30 kDa. The data obtained for the lectin of Crota/aria paulina, when compared to the one obtained from Crota/aria juncea and Crota/aria striata showed that in spite of belonging to the same genus they possess different agglutination properties and specificity for carbohydrate. On ADPinduced platelet aggregation assay with human plasma up to 100ug/ml of the lectin showed no significant modulation on platelets. Studies of CrpL on Xanthomonas campestris pv. phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae, showed that the lectin was able to inhibit the growth and development these bacteria. The evaluation of proteinaceous inhibitors of proteolytic enzymes as candidates to provide resistance to economically important crops against insect pests is currently attracting much research interest. The antimetabolic properties of the SPI after incorporation into artificial diet, in vivo, and its interference on population increase potential of the pest have been evaluated. The incorporation of SPI into an artificial diet of larvae significantly reduced the growth and development of the insect, reflecting an increase of the instar number and duration, and a significantly lower average weight. It was also observed that the diet nutrition value affects the insect susceptibility to the inhibitor. The effect on growth rates observed in this study resulted in significant differences in mean weights of larvae at the conclusion of the experiment (day 16). Here, the mean weight of larvae fed on control diet was significantly greater than the mean weight of larvae fed diet containing proteinase inhibitors CpTI and SSTI. The study of the effects from CpTI, CsTI, CjTI, SBTI and PVTI on the mycelial growth of the genus Fusarium and Colletotrichum were carried out on Petri slabs, using medium of BOA for Fusarium sp and medium of oat for Colletotrichum graminicola, with 10 repetitions. Sterilized water was used as control. Plates were kept at 28°C in the dark. When the control reached the whole diameter of plate, the experiment was interrupted. Inhibitors showed different effects on the growth of Fusarium sp in vitro. CpTI did not show any effects in relation to the control, and PvTI did not have effects but reduced the concentration of hyphas. CpTI had effect and occasioned a change in the colony morphology. CjTi and PvTI showed antifungal effect on the growth of Colletotrichum graminicola, being that PvTI showed itself quite efficient in the growth control of the colony. CpTI were able to inhibit the bacterial development and growth of the two pathogenic bacteria species of Xanthomonas, Xanthomonas campestris pv. Phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae. BvcTI was also able to inhibit the bacterial growth of Xanthomonas sp. On the other hand, PvTI it was not effective against these bacteria. The results presented here suggest that CrpL and proteinase inhibitors may be involved in the defense mechanism against pathogenic microorganisms. These results suggest also a potential value of SPI for protecting sugarcane plants against damage by Diatraea saccharalisDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula

Purificação, caracterização fisico-quimica e atividade biologica de inibidores de serinoproteinases de sementes do genero Crotalaria

Orientador: Sergio MarangoniDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulinaAbstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extractMestradoBioquimicaMestre em Ciências Biológica

Purification and evaluation of the interference of BthMP (a metalloprotease from Bothrops moojeni) in blood clotting

In the present was work reported the purification of the metalloprotease BthMP, from the venom of Bothrops moojeni. For purification of the protease was used ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose) and molecular exclusion (Sephadex G-75), the product of these processes was a protein band with high purity, visualized on SDS-PAGE 14%, referred the BthMP. This protease when analyzed on MALDI-TOF revealed the molecular weight of the native form of 23.050 Da and 23.872 Da in the reduced form, and from the peptide fragments obtained by Peptide Mass Fingerprinting (PMF) in MS (MALDI-TOF/TOF) was observed high similarity with BmooMPα-I metalloprotease. In enzymatic terms, BthMP showed proteolytic activity on azocasein using PMSF and benzamidine, while this activity was inhibited in the presence of EDTA; 1,10-Phenanthroline and β-mercaptoethanol, it is therefore a zinc-dependent metalloprotease of the class P-I. To still with this purpose, we contemplate its enzymatic specificity of the Aα and Bβ chains of fibrinogen and also the consumption of fibrinogen in vivo. It was also found its action on the components of the coagulation cascade, due to prolongation of prothrombin time and partial thromboplastin time. Thus, the sharp fibrinogenolytic activity and the high consumption of fibrinogen in vivo are results that indicate the anticoagulant action of BthMP; furthermore, their ability to interfere with the coagulation cascade suggested that this protease is promising for future studies that might indicate a new antithrombotic agent model