Estudo da malária de primatas não humanos e sua relação com a malária humana no Estado de Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental do Departamento de Medicina da Fundação Universidade Federal de Rondônia, como requisito parcial par obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental.Em estudos anteriores sobre a malária em primatas não humanos, nativos de florestas do continente Americano, estão registradas apenas duas espécies de plasmódios, Plasmodium brasilianum e P. simium, parasitas semelhantes aos da malária humana, P. malariae e P. vivax, respectivamente. Estes parasitas infectam naturalmente primatas da família Cebidae e Atelidae. O P. brasilianum foi observado em ampla distribuição geográfica e parasitando um grande número de espécies de primatas, ao contrário do P. simium, restrito a três espécies nas áreas do Sul e Sudeste da Mata Atlântica do Brasil. Todavia, é possível que essa distribuição reflita uma subestimação, pois esses dados foram baseados, em sua maioria, em análises microscópicas e penalizadas pelas dificuldades em obter amostras, limitando-as a um pequeno número de animais. A introdução, no presente trabalho, de metodologias moleculares em adição à microscopia para a detecção e identificação dos parasitas da malária, permite abordar o problema das relações entre malária de primatas não humanos e malária humana, uma vez que interpretações conflitantes sobre a origem humana das malárias de primatas não humanos no continente Americano ou, ao contrário, origem simiana da malária humana, tem sido proposta por diferentes autores. Peculiaridades da região de Rondônia, com áreas florestais de instabilidade devido à intensa intervenção ambiental de origem humana favorecendo o contato entre o homem e animais da floresta, permitiu um estudo preliminar da prevalência da malária de primatas não humanos e sua possível relação com a malária humana local. Foram coletadas 184 amostras de sangue de primatas não humanos e analisadas utilizando-se microscopia e técnicas moleculares. As amostras estudadas foram de animais silvestres e de cativeiro. Os animais silvestres foram de duas origens: (i) áreas de instabilidade ecológica (local de construção de hidrelétricas, extração de madeira, etc) e (ii) áreas atualmente estáveis (antigas áreas de mineração e extração de borracha, atividade agrícola estável, etc.). De forma geral, a frequência de infecções por Plasmodium foi de 10,3% (19/184), sendo maior em animais selvagens (12,6%) do que em animais de cativeiro (4,1%). A maioria das infecções observadas nos animais de diferentes espécies foi por P. brasilianum (18/19). Nenhum caso de infecção por P. simium foi detectado. No entanto, foram observados 3 casos de infecção por P. falciparum, estes em animais silvestres e de cativeiro (1,6%), sendo 2 dos casos infecções mistas com P. brasilianum. Todas as amostras positivas foram de animais pertencentes às famílias Cebidade, Atelidae, Pitheciidae e um dos casos de infecção por P. brasilianum inclui pela primeira vez a família Aotidae. A prevalência de P. brasilianum em primatas não humanos capturados em área próxima a habitações humanas, bem como casos de P. malariae na população humana local e casos positivos de P. falciparum em primatas não humanos constituem evidências adicionais da possível interrelação entre malária humana e de primatas não humanos e que estes podem eventualmente constituir em reservatório natural para a malária humana, o que implicaria em futuras ações de controle da doença na região

Estudos sobre o envolvimento de clag9 (cytoadherence linked asexual gene) durante a remodelação do eritrócito infectado com Plasmodium falciparum e sua participação no desenvolvimento da imunidade em malária

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Doutorado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da SilvaNo presente estudo foi avaliado possível papel indireto do PfCLAG9 na citoaderência e a participação como alvo imunológico. Foram analisadas amostras de parasitos de P. falciparum isolados de pacientes da região de Porto Velho, Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira, os quais foram submetidos a ciclos sucessivos de panning para os receptores endoteliais. O experimento consistiu de sequenciar, comparar a expressão relativa do gene Pfclag 9 utilizando o método da PCR em tempo real e ensaios de imunodetecção. Foram desenhados peptídeos sintéticos de diferentes regiões da proteína CLAG9, avaliadas a antigenicidade em soros dos pacientes sintomáticos e assintomáticos com Plasmodium sp. Os isolados de pacientes com P. falciparum, P3, P5 e P59 e suas linhagens selecionadas com especificidade para os receptores CHO CSA-K1, CHO CD36, CHO ICAM-1, não demonstraram uma variação na expressão do gene Pfclag9 quando comparados com os genes normalizadores. A região sequenciada demonstrou similaridade de 100%, quando comparadas com a cepa de referência 3D7. Na análise sorológica realizada com os peptídeos sintéticos foi observada uma maior reatividade em soros de portadores assintomáticos e confirmados os estudos realizados Papua-Nova Guiné e na Colômbia. Surpreendentemente, os portadores assintomáticos com parasitos de P. vivax, também demonstraram um elevado grau de reatividade cruzada contra os mesmos peptídeos de P. falciparum. A análise nos bancos de antígenos por bioinformática demonstrou um elevado grau de similaridade entre as sequências de PfCLAG9 e PvCLAG7 (84%). Paralelamente, os anti-soros policlonais de BALB/c interagiram com os parasitos de vivax e falciparum. O resultado reforça a proposta de PvCLAG7 como ortólogo de PfCLAG9 e pode sugerir o mesmo papel funcional para ambas as proteínas. Isso suscita a hipótese de que eles podem estar envolvidos na regulação da densidade populacional durante a infecção mista exercida pela resposta immune do hospedeiro, além de provavelmente desempenhar funções importantes em ambas às espécies do parasito

Endemias e epidemias na Amazônia: malária e doenças emergentes em áreas ribeirinhas do Rio Madeira. Um caso de escola

The authors present a short review on the evolution of malaria incidence in the Brazilian Amazon, with particular reference to the Rondônia State and the Municipality of Porto Velho, where dramatic epidemics of malaria and other tropical diseases have been registered in the past. Next, they analyze the present endemic malaria situation in the Madeira River Valley where two important Hydroelectric Power Plants will be constructed in the localities of Santo Antônio and Jirau. Longitudinal surveys performed in the last four years in this area allow to demonstrate a high prevalence of symptomatic and asymptomatic malaria carriers in the area, associated to the presence of high densities of the malaria vector Anopheles darlingi all over the year. These elements are correlated to the expected arrival of a large number of human migrants originated from non endemic areas of Rondônia and other Brazilian States, attracted by the possibility of jobs in the Hydroelectric Power Plants and by secondary opportunities in commerce, leisure, education and domestic activities. These associations create favorable conditions for malaria outbreaks and other tropical diseases that must be avoided by the establishment of additional control measures, in particular in the sanitation domainApós fazer uma análise da evolução da malária na Amazônia brasileira, detalhando em particular a situação em Rondônia e no município de Porto Velho, onde ocorreram episódios dramáticos de epidemias de malária no passado, os autores apresentam o quadro atual da prevalência de malária nas áreas do Vale do Rio Madeira, que sofrerão impactos com a construção das hidrelétricas de Santo Antônio e Jirau, e alertam sobre a situação particular da malária em áreas ribeirinhas. Nessas áreas, observam-se alta incidência de malária vivax e falciparum, a presença de grande número de portadores assintomáticos de parasitas e altas densidades do vetor Anopheles darlingi o ano todo. Esses elementos, associados à provável chegada de migrantes oriundos de áreas não-endêmicas de Rondônia e de outros Estados do país, atraídos pela possibilidade de trabalho nessas hidrelétricas e oportunidades de comércio, lazer, educação e atividades domésticas, criam condições favoráveis à ocorrência de epidemias de malária e de outras doenças tropicais se não forem realizadas intervenções adequadas de controle, em particular no domínio do saneamento

Estudo cinético da enzima 2-trans-enoil-acp-redutase (e.c. 1.3.1.9) de plasmodium falciparum e ensaios de inibição pelo composto pentaciano (isoniazida) ferrato II

Tese de Doutorado apresentada à Fundação Universidade Federal de Rondônia, como requisito para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental.A Malária promove um pesado tributo sobre a saúde e a qualidade de vida dos residentes de países intertropicais, afetando um terço da população humana do mundo. Aproximadamente 90% de todas as mortes causadas por malária ocorrem em crianças Africanas com idade inferior a cinco anos. A disseminação da resistência aos fármacos utilizados na quimioterapia causou uma preocupação recente referente à malária, destacando a necessidade urgente por novos medicamentos e novos alvos biológicos. A abordagem moderna para o desenvolvimento de novas compostos químicos contra as doenças complexas, principalmente as doenças endêmicas negligenciadas como malária e tuberculose, é baseada no uso de alvos moleculares definidos. O parasita da malária humana, protozoário do gênero Plasmodium, sintetiza ácidos graxos empregando o sistema de biossíntese de ácidos graxos Tipo II (FAS II), ao contrário dos humanos que dependem da via Tipo I (FAS I). O sistema FAS II alonga os precursores acil da membrana celular em Plasmodium. A enzima 2-trans-enoil-ACP-redutase (ENR) é um membro do sistema FAS II. Neste trabalho são apresentados dados de cinética em estado estacionário, cinética em estado pré-estacionário, e de espectroscopia de fluorescência em equilíbrio que nos permitiram propor um mecanismo enzimático de deslocamento duplo para a ENR de P. falciparum (PfENR). Além disso, o presente estudo avalia também a inibição da PfENR pelo composto pentaciano (isoniazida) ferrato II. Nossos resultados mostraram que este composto é um inibidor de ação lenta (slow-onset inhibitor) da atividade de PfENR. Neste mecanismo de ação, um complexo enzima-inibidor inicial é rapidamente formado e, em seguida, sofre uma reação de isomerização lenta para um complexo binário enzima-inibidor, no qual o inibidor é mais fortemente ligado à enzima. Desta forma, o complexo pentaciano (isoniazida) ferratoII representa uma nova classe de compostos líderes para o desenvolvimento de agentes antimaláricos voltados para a inibição da PfENR

Enzyme Mechanism and Slow-Onset Inhibition of Plasmodium falciparum Enoyl-Acyl Carrier Protein Reductase by an Inorganic Complex

Malaria continues to be a major cause of children's morbidity and mortality worldwide, causing nearly one million deaths annually. The human malaria parasite, Plasmodium falciparum, synthesizes fatty acids employing the Type II fatty acid biosynthesis system (FAS II), unlike humans that rely on the Type I (FAS I) pathway. The FAS II system elongates acyl fatty acid precursors of the cell membrane in Plasmodium. Enoyl reductase (ENR) enzyme is a member of the FAS II system. Here we present steady-state kinetics, pre-steady-state kinetics, and equilibrium fluorescence spectroscopy data that allowed proposal of P. falciparum ENR (PfENR) enzyme mechanism. Moreover, building on previous results, the present study also evaluates the PfENR inhibition by the pentacyano(isoniazid)ferrateII compound. This inorganic complex represents a new class of lead compounds for the development of antimalarial agents focused on the inhibition of PfENR

Amazonian biodiversity: a view of drug development for Leishmaniasis and malaria

Chemotherapy is the only validated therapy for the treatment for the neglected diseases leishmaniasis and malaria. However, the emergence of drug resistance, collateral effects and long-term treatment encourage the development of new and more efficient drugs. The Amazon tropical forest includes the richest areas of biodiversity in the world, including a great number of microbes, plant and animal species that produce a source of interesting biologically active molecules. Several of these molecules, obtained from plant extracts and frog venom have leishmanicidal and plasmodicidal activity, highlighting the potential of this biodiversity for the development of new drugs. In research, modern approaches in new drug development are carried out using combinatorial chemistry, high-throughput screening, bioinformatics, molecular interaction, crystallography and dynamic studies of cellular and systemic toxicity. In Brazil, these techniques are mainly present in only a few academic groups with no efficient connection to industry. The problem associated with over-regulation for accessing the biological material in restricted areas, local populations and indigenous areas places major barriers in the path of research and development of new drugs. Thus, the association of academic research groups in Brazil, encouraged and supported by government and industry, is essential to overcome these major barriers related to the development of new products for treatment of neglected diseases from Amazonian biodiversity in future years.A quimioterapia é o único procedimento farmacológico validado para a terapêutica da leishmaniose e da malária, consideradas doenças negligenciadas para o desenvolvimento de fármacos pelas indústrias farmacêuticas. Com a não renovação medicamentosa, o surgimento de resistência, os efeitos colaterais e o longo período de tratamento indicam a necessidade do desenvolvimento de novos e mais eficientes fármacos. A Floresta Amazônica é a região com a maior biodiversidade do planeta, com uma riqueza de animais e plantas produtoras de moléculas com atividades biológicas relevantes para o desenvolvimento e exploração biotecnológica. Algumas destas moléculas, obtidas de extratos vegetais e de venenos de anuros, apresentam atividade leishmanicida e plasmodicida, o que demonstra o potencial desta biodiversidade para a investigação de novas drogas. A moderna abordagem na pesquisa de novos fármacos envolve a associação de química combinatória, high-throughput screening, bioinformática, interação molecular, cristalografia e o estudo dinâmico de toxicidade sistêmica e celular, que atualmente no Brasil, estão distribuídas em poucos grupos acadêmicos sem a devida associação industrial. Esta deficiência, agregada ao excesso de regulamentação para o acesso ao material biológico, sobretudo, proveniente de unidades de conservação, populações tradicionais e nações indígenas, é um importante entrave para o desenvolvimento deste tipo de pesquisa. A associação de grupos de pesquisa do Brasil, estimulados por políticas governamentais de financiamento acadêmico e industrial, são essenciais para a superação destas dificuldades, de forma que nos próximos anos possam surgir novos produtos para terapia de doenças negligenciadas oriundas da biodiversidade amazônica

Natural antibody response to Plasmodium falciparum merozoite antigens MSP5, MSP9 and EBA175 is associated to clinical protection in the Brazilian Amazon

BACKGROUND: Antibodies have an essential role in the acquired immune response against blood stage P. falciparum infection. Although several antigens have been identified as important antibody targets, it is still elusive which antigens have to be recognized for clinical protection. Herein, we analyzed antibodies from plasmas from symptomatic or asymptomatic individuals living in the same geographic area in the Western Amazon, measuring their recognition of multiple merozoite antigens. METHODS: Specific fragments of genes encoding merozoite proteins AMA1 and members of MSP and EBL families from circulating P. falciparum field isolates present in asymptomatic and symptomatic patients were amplified by PCR. After cloning and expression of different versions of the antigens as recombinant GST-fusion peptides, we tested the reactivity of patients’ plasmas by ELISA and the presence of IgG subclasses in the most reactive plasmas. RESULTS: 11 out of 24 recombinant antigens were recognized by plasmas from either symptomatic or asymptomatic infections. Antibodies to MSP9 (X(2)(DF=1) = 9.26/p = 0.0047) and MSP5 (X(2)(DF=1) = 8.29/p = 0.0069) were more prevalent in asymptomatic individuals whereas the opposite was observed for MSP1 block 2-MAD20 (X(2)(DF=1) = 6.41/p = 0.0206, Fisher’s exact test). Plasmas from asymptomatic individuals reacted more intensely against MSP4 (U = 210.5, p < 0.03), MSP5 (U = 212, p < 0.004), MSP9 (U = 189.5, p < 0.002) and EBA175 (U = 197, p < 0.014, Mann-Whitney’s U test). IgG1 and IgG3 were predominant for all antigens, but some patients also presented with IgG2 and IgG4. The recognition of MSP5 (OR = 0.112, IC(95%) = 0.021-0.585) and MSP9 (OR = 0.125, IC(95%) = 0.030-0.529, cross tab analysis) predicted 8.9 and 8 times less chances, respectively, to present symptoms. Higher antibody levels against MSP5 and EBA175 were associated by odds ratios of 9.4 (IC(95%) = 1.29-69.25) and 5.7 (IC(95%) = 1.12-29.62, logistic regression), respectively, with an asymptomatic status. CONCLUSIONS: Merozoite antigens were targets of cytophilic antibodies and antibodies against MSP5, MSP9 and EBA175 were independently associated with decreased symptoms

Rotavirus and adenovirus in Rondônia

The present work consists of analysis of the Work Routine Management development and implementation, in a process (register) of Operational Units in an Agro-industrial Cooperative, in order to use management tools that facilitate the identification of possible problems that hamper the results and their respective causes, and the execution of routine activities. The analysis consists of process mapping, creation and review of process indicators, as well as the definition of goals for monitoring and activating Routine Management. It also includes the survey of opportunities for improvement and the definition of an action plan in order to optimize the process for those involved, making it possible to act by monitoring the results obtained, tracing future actions and not only for correcting mistakes occurred during work routines