Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad

[ES] El sistema de melanocortinas es un sistema hormonal crítico en la respuesta al estrés y el control del balance energético. Sus péptidos agonistas, las hormonas estimuladoras de los melanocitos (MSHs) y la hormona adrenocorticotropa (ACTH) están codificados en un precursor común denominado proopiomelanocortina (POMC). Sus efectos se medían a través de 5 receptores (MCRs) que exhiben farmacologías y dominios de expresión particulares. Los efectos de los agonistas son contrarrestados por la acción de dos antagonistas endógenos, la proteína de señalización agutí (ASIP) y la proteína relacionada con agutí (AGRP), que pueden actuar como agonistas inversos de los receptores activados constitutivamente. Para aumentar la complejidad del sistema hormonal existen dos proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) que interaccionan físicamente con los receptores para permitir (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) la expresión funcional de los mismos. La MRAP1 es imprescindible para la migración a la membrana plasmática del MC2R mientras que la MRAP2 interactúa con el resto de receptores para modular su actividad. Experimentos anteriores demostraron que, en el pez cebra, uno de los dos parálogos de MRAP2 (MRAP2a) es capaz de interactuar con el MC4R, un receptor canónico de la MSH, transformándolo en un receptor de ACTH. Los experimentos recogidos en esta tesis doctoral demuestran que esta función se ha conservado evolutivamente y esta conservación evolutiva sugiere la existencia de un rol fisiológico para la interacción MRAP2-MC4R. Este rol puede estar relacionado con la trasmisión de información desde el eje hipotálamo-hipófisis-interrenal, que regula la respuesta al estrés hacia los sistemas centrales que controlan el balance energético. Además, proponemos que dicha interacción oferta un mecanismo molecular potencial para la explicación de los beneficios de la terapia con ACTH en el síndrome de espasmos infantiles. Nuestro segundo objetivo fue caracterizar molecularmente la interacción entre ambas proteínas (MRAP2 y MC4R) utilizando una estrategia de receptores quiméricos. Experimentos previos en nuestro laboratorio habían demostrado que la interacción MRAP2a-MC1R no provocaban una alteración farmacológica del receptor. Por tanto, nuestra estrategia fue sustituir diferentes dominios del MC4R por aquellos homólogos del MC1R esperando una pérdida de función, es decir una pérdida de la sensibilidad a ACTH inducida por la MRPA2a en el receptor quimérico. Una vez detectados estos dominios fundamentales optamos por la estrategia contraria, es decir, la substitución de dominios del MC1R por aquellos homólogos del MC4R esperando una ganancia de función. Los resultados demuestran que la substitución conjunta de los dominios transmembranales (TM) 3, 5 y 7 conjuntamente con el segundo y tercer giros extracelulares (ECL) del MC4R sobre el MC1R confiere sensibilidad a ACTH al receptor quimérico. Basándonos en los modelos estructurales de la interacción de diversos agonistas con el MC4R, nuestros resultados otorgan luz sobre la relación funcional entre la MRPA2a y el MC4R y permiten inferir modelos de interacción especulativos. Resultados transcriptómicos previos del grupo de investigación habían sugerido la participación del sistema de melanocortinas en la regulación del reloj circadiano, por tanto, nuestro siguiente objetivo fue demostrar esta interrelación. Para ello utilizamos el paradigma de la actividad locomotora circadiana habitualmente utilizada para el estudio de los ritmos circadianos. En primer lugar, y para poner a punto el sistema de registro de la actividad, estudiamos las diferencias de actividad locomotora entre grupos aislados de machos y hembras mostrando que bajo estas condiciones de aislamiento los ritmos de actividad locomotora son dependientes del sexo, además también demostramos que la administración oral de esteroides opuestos al sexo fenotípico, es decir estradiol en machos y 11-ceto-androstenediona (como precursor de la 11- cetotestosterona) en hembras, revertía parcialmente los efectos del sexo sobre el perfil locomotor. Finalmente quisimos estudiar la posible interacción del sistema de melanocortinas y la regulación del reloj circadiano demostrando que la sobreexpresión de antagonistas endógenos en modelos de transgénesis en el pez cebra modifica el patrón de actividad de los animales. Los animales transgénicos exhiben una mayor actividad significativa especialmente durante el periodo nocturno. Estos datos concuerdan con datos ya publicados por nuestro grupo de investigación donde se demuestra la ausencia de diferencias significativas en los niveles de melatonina entre el día y la noche en animales transgénicos.[CA] El sistema de melanocortines és un sistema hormonal crític en la resposta a l’estrès i el control del balanç energètic. Els seus pèptids agonistes, les hormones estimuladores dels melanòcits (MSHs) i l’hormona adrenocorticotropa (ACTH) estan codificats en un precursor comú denominat proopiomelanocortina (POMC). Els seus efectes es mesuraven a través de 5 receptors (MCRs) que exhibeixen farmacologies i dominis d’expressió particulars. Els efectes dels agonistes són contrarestats per lacció de dos antagonistes endògens, la proteïna de senyalització agutí (ASIP) i la proteïna relacionada amb agutí (AGRP), que poden actuar com agonistes inversos dels receptors activats constitutivament. Per a augmentar la complexitat del sistema hormonal existeixen dos proteïnes accessòries dels receptors de melanocortines (MRAPs) que interaccionen físicament amb els receptors per a permetre (MC2R) o modular (MC1R, MC3R, MC4R, MC5R) l’expressió funcional dels receptors. La MRAP1 és imprescindible per la migració a la membrana plasmàtica del MC2R mentres que la MRAP2 interactúa amb la resta de receptors per a modular la seua activitat. Experiments anteriors van demostrar que, en el peix zebra, un dels dos paràlegs de MRAP2 (MRAP2a) és capaç d’interactuar amb el MC4R, un receptor canònic de la MSH, transformant-lo en un receptor d’ACTH. Els experiments recollits en aquesta tesis doctoral demostren que aquesta funció s’ha conservat evolutivament i aquesta conservació evolutiva suggereix l’existència d’un rol fisiològic per a la interacció MRAP2-MC4R. Aquest rol pot estar relacionat amb la transmissió d’informació des de l’eix hipotàlam-hipòfisis-interenal que regula la resposta a l’estrès cap als sistemes centrals que control·len el balanç energètic. A més a més, proposem que l’esmentada interacció oferta un mecanisme molecular potencial per l’explicació dels beneficis de la teràpia amb ACTH en síndrome d’espasmes infantils. El nostre segon objectiu fou caracteritzar molecularment la interacció entre ambdues proteïnes (MRPA2 y MC4R) utilitzant una estratègia de receptors quimèrics. Experiments previs al nostre laboratori havien demostrat que la interacció MRAP2a-MC1R no provocaven una alteració farmacològica del receptor. Per tant, la nostra estratègia fou substituir diferents dominis del MC4R per aquells homòlegs del MC1R esperant una pèrdua de funció, és dir una pèrdua de la sensibilitat a ACTH induïda per la MRPA2a en el receptor quimèric. Una vegada detectats aquests dominis fonamentals optem per l’estratègia contrària, és a dir, la substitució de dominis del MC1R per aquells homòlegs del MC4R esperant una ganància de funció. Els resultats demostren que la substitució conjunta dels dominis transmembranals (TM) 3, 5 i 7 conjuntament amb el segon i tercer girs extracelulars (ECL) del MC4R sobre el MC1R confereix sensibilitat a ACTH al receptor quimèric. Basant-nos en els models estructurals de la interacció de diversos agonistes amb el MC4R els nostres resultats atorguen llum sobre la relació funcional entre la MRPA2a i el MC4R i permiteixen inferir models d’interacció especulatius. Resultats transcriptòmics previs del grup d’investigació havien suggerit la participació del sistema de melanocortines en la regulació del rellotge circadià, per tant, el nostre següent objectiu fou demostrar aquesta interrelació. Per a això utilitzem el paradigma de l’activitat locomotora circadiana habitualment utilitzada per l’estudi dels ritmes circadians. En primer lloc, i per posar a punt el sistema de registre de l’activitat, estudiem les diferències d’activitat locomotora entre grups aïllats de mascles i femelles mostrant que baix aquestes condicions d’aïllament els ritmes d’activitat locomotora són dependents del sexe, a més a més també demostrem que l’administració oral de esteroïdes oposats al sexe fenotípic, és a dir estradiol en mascles i 11-ceto-androstenediona (com a precursor de la 11- cetotestosterona) en femelles, revertia parcialment els efectes del sexe sobre el perfil locomotor. Finalment vam voler estudiar la possible interacció del sistema de melanocortines i la regulació del rellotge circadià demostrant que la sobreexpressió d’antagonistes endògens en models de transgènesis en el peix zebra modifica el patró d’activitat dels animals. Els animals transgènics exhibeixen una major activitat significativa especialment durant el període nocturn. Aquestes dades concorden amb dades publicades anteriorment pel nostre grup d’investigació on es demostra l’absència de diferències significatives en els nivells de melatonina entre el dia i la nit en animals transgènics.[EN] Melanocortin system is a key hormonal system in the regulation of stress response and the control of energy balance. Peptide agonist, the melaninstimulating hormones (MSHs) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) are encoded in a common precursor named proopiomelancortin (POMC). Their effects are mediated through five receptors that exhibit different expression domains and pharmacological properties. Agonist effects are counterbalanced by the action of endogenous competitive antagonist, agouti-signalling protein (ASIP) and agoutirelated protein (AGRP) that can also work as inverse agonist at constitutive activated receptors. To increase the complexity of the hormonal system, two melanocortin receptor accessory proteins (MRAPs) physically interplay with the melanocortin receptors to allow (MC2R) or modulate (MC1R, MC3R, MC4R, and MC5R) the functional expression of the receptors. MRAP1 is critical for the MC2R traffic to the plasma membrane whereas MRAP2 interacts with the remaining receptors to modulate their activity. Our previous experiments demonstrated that, in the zebrafish, one of the two MRAP2 paralogues (MRAP2a) is able to physically interact with the MC4R, a canonical MSH receptor, to become an ACTH receptor. Experiments in the doctoral thesis demonstrate that this function is conserved and this evolutionary conservation suggests a physiological role for the MC4R-MRAP2 interaction. This role can be related to the information relay from the hypothalamic-pituitaryinterrenal axis, that regulates the stress response, to the central systems that controls energy balance. In addition, we propose that this interaction can be the molecular substrate explaining the ACTH therapy of the infantile spasm syndrome in humans. One second objective was to molecularly characterize the interaction between both proteins (MC4R and MRAP2a) using a receptor quimeras strategy. Previous experiments in our lab demonstrated that the interaction of MRAP2a with MC1R cannot modify the pharmacological profile of the receptor. Therefore, our strategy was to exchange different receptor domains of the MC4R with those homologues in the MC1R looking for a loss of function, i.e. a loss of the MRAP2ainduced ACTH sensitivity. Once characterized the main domains responsible for a loss of function in the MC4R quimeras, we follow the opposite strategy, i.e. exchange the critical domains of MC4R into MC1R waiting for a gain of function in the new MC1R quimeras. Our results demonstrate that integrated substitution of the transmembrane domains (TM) 3, 5, and 7 together with the external loops (ECL) 2 and 3 provides ACTH sensitivity to the new MC1R quimeras. Following several structural models of the interaction between different agonists with the melanocortin receptors, our results provides some light on the functional relationship between MRAP2a and MC4R and allow to infer some interactive and speculative models. Previous transcriptomic results in the research group suggested the involvement of the melanocortin system in the regulation of circadian clock, therefore, our following objective was to demonstrate this interaction. To that, we use the circadian locomotor activity paradigm usually utilized for the study of circadian rhythms. First and with the aim to set up the recording systems we studied the potential differences between the locomotor activity patterns between isolated groups of males and females showing that under these conditions of grouped-sex isolation the locomotor activity is sex-dependent, moreover we also demonstrate that the oral administration of opposed sex steroids to the phenotypic sex, i.e. 17-estradiol to males and 11-ketoandrostenedione (as 11-keto-testosterone precursor) to females was able to revert the sex effects on locomotor pattern. Finally, we wanted to study the potential interaction of the melanocortin system and the regulation of circadian clock using the previous setup thus demonstrating that the overexpression of ASIP in transgenic models modifies the locomotor activity. The transgenic animals exhibit higher global activity specially during the nocturnal period. These data are in well-agreement with those previously reported by our research group showing the absence of significant differences between brain melatonin levels during the light and dark period of the photoperiod in transgenic animals.La presente Tesis Doctoral llevada a cabo en el Departamento de Fisiología de peces y biotecnología del Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC); se realizó con la ayuda del apoyo económico del Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. Lucía Soletto Esteban ha sido beneficiaria de un contrato de Formación de Personal Investigador (FPI) ( BES-2014-070372) para la realización del proyecto “Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad” (AGL2013-46448-C3-3-R). Parte de la financiación ha sido obtenida de proyectos de investigación entre los cuales destaca: “Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces” (MELANOCONDUCT) (AGL2016-74857-C3-3-R) Proyectos I+D+I, RETOS. Parte del trabajo experimental fue realizado en colaboración con el Prof. Nicholas S. Foulkes, del Instituto de Toxicología y Genética (ITG) del Instituto Tecnológico de Karlsruhe (KIT) de Alemania. Los fondos económicos para la realización de esta estancia breve de investigación fueron proporcionados por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (EEBB-I-16-11803).Soletto Esteban, L. (2020). Estudios de estructura-actividad de la interacción entre el receptor de melanocortinas tipo 4 (MC4R) y las proteínas accesorias de los receptores de melanocortinas (MRAPs) e implicación de las melanocortinas en la regulación de los ritmos circadianos de actividad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/152296TESI

About a heat and mass transfer process reflection in phase plane

Darbā aplūkota pirmās kārtas nelineāra parasto diferenciālvienādojumu sistēma, kura radusies apskatot koksnes žāvēšanas matemātisko modeli. Šī sistēma pārnesta fāzu plaknē, noskaidrota atrisinājuma atkarība no mitras koksnes blīvuma, apkārtējā gaisa plūsmas ātrumaun koka plāksnes biezuma vērtībām. Bibliogrāfijā 8 nosaukumi Atslēgas vārdi: pirmās kārtas nelineāra parasto diferenciālvienādojumu sistēma, fāzu plaknes analīzes metode.In this work was a system of first order nonlinear ordinary differential equation examined, that came from inspecting the model of wood drying. This system was transmitted in to phase plane and established the solutions dependence of wet web density, velocity of around air and wood plate thickness values. Bibliography 8 items Keywords: first order nonlinear ordinary differential equation system, phase plane analyses method

Brain transcriptome profile after CRISPR-induced ghrelin mutations in zebrafish

Ghrelin (GRL) is a gut-brain hormone with a role in a wide variety of physiological functions in mammals and fish, which points out the ghrelinergic system as a key element for the appropriate biological functioning of the organism. However, many aspects of the multifunctional nature of GRL remain to be better explored, especially in fish. In this study, we used the CRISPR/Cas9 genome editing technique to generate F0 zebrafish in which the expression of grl is compromised. Then, we employed high-throughput mRNA sequencing (RNA-seq) to explore changes in the brain transcriptome landscape associated with the silencing of grl. The CRISPR/Cas9 technique successfully edited the genome of F0 zebrafish resulting in individuals with considerably lower levels of GRL mRNAs and protein and ghrelin O-acyl transferase (goat) mRNAs in the brain, intestine, and liver compared to wild-type (WT) zebrafish. Analysis of brain transcriptome revealed a total of 1360 differentially expressed genes (DEGs) between the grl knockdown (KD) and WT zebrafish, with 664 up- and 696 downregulated DEGs in the KD group. Functional enrichment analysis revealed that DEGs are highly enriched for terms related to morphogenesis, metabolism (especially of lipids), entrainment of circadian clocks, oxygen transport, apoptosis, and response to stimulus. The present study offers valuable information on the central genes and pathways implicated in functions of GRL, and points out the possible involvement of this peptide in some novel functions in fish, such as apoptosis and oxygen transport