Probiotic Sonicates Selectively Induce Mucosal Immune Cells Apoptosis Through Ceramide Generation Via Neutral Sphingolyelinase

Background: Probiotics appear to be beneficial in inflammatory bowel disease, but their mechanism of action is incompletely understood. We investigated whether probiotic-derived sphingomyelinase mediates this beneficial effect. Methodology/Principal Findings: Neutral sphingomyelinase (NSMase) activity was measured in sonicates of the probiotic L.brevis (LB)and S. thermophilus (ST) and the non-probiotic E. coli EC) and E. faecalis (EF). Lamina propria mononuclear cells (LPMC) were obtained from patients with Crohn"s disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy volunteers, analysing LPMC and PBMC apoptosis susceptibility, reactive oxygen species (ROS) generation and JNK activation. In some experiments, sonicates were preincubated with GSH or GW4869, a specific NSMase inhibitor. NSMase activity of LB and ST was 10-fold that of EC and EF sonicates. LB and ST sonicates induced significantly more apoptosis of CD and UC than control LPMC, whereas EC and EF sonicates failed to induce apoptosis. Pre-stimulation with anti-CD3/CD28 induced a significant and time-dependent increase in LB-induced apoptosis of LPMC and PBMC. Exposure to LB sonicates resulted in JNK activation and ROS production by LPMC. NSMase activity of LB sonicates was completely abrogated by GW4869, causing a dose-dependent reduction of LB -induced poptosis. LB and ST selectively induced immune cell apoptosis, an effect dependent on the degree of cell activation and mediated by bacterial NSMase. Conclusions: These results suggest that induction of immune cell apoptosis is a mechanism of action of some probiotics and that NSMase-mediated ceramide generation contributes to the therapeutic effects of probiotics

Mecanismes de senyalització intracel·lulars en isquèmia/reperfusió hepàtica

El dany produït per isquèmia/reperfusió (I/R) pot ser un problema clínic per a diferents òrgans com el cervell, cor, ronyó o fetge, i és un fenomen on el dany cel·lular en un òrgan hipòxic és accentuant per la subsegüent arribada d'oxigen.El dany hepàtic per I/R pot donar-se durant transplantaments, xocs circulatoris i reseccions de fetge per a tumors, i a més, contribueix a disminuir la quantitat de fetges disponibles per a ser trasplantats a causa de l'elevada susceptibilitat dels fetges marginals a la isquèmia. En efecte doncs, minimitzar els efectes adversos del dany per I/R podrien significar un augment dels èxits en els trasplantaments hepàtics.La isquèmia ja causa certa mort cel·lular per se, però el principal dany hepàtic es manifesta durant el procés de reperfusió. El procés del dany produït per I/R combina molts factor interrelacionats que produeixen una cascada de respostes que culminen amb una fallida hepàtica. Hi ha una clara activació de cèl·lules de Kupffer, cèl·lules polimorfonuclears i cèl·lules endotelials. L'apoptosi, o mort cel·lular programada, és reconeguda com a clau en el dany produït per isquèmia/reperfusió, essent el factor de necrosi tumoral (TNF) un element crític en aquest procés. En aquest context, la ceramida ha emergit com un lípid intermediari que juga un rol important en la resposta a l'estrès i mort cel·lular induïda per TNF. Tot i que els nivells de ceramida poden incrementar per la via de síntesis de novo, la hidròlisi de la esfingomielina mitjançant l'activació d'esfingomielinases (SMases), tant l'àcida com la neutra, constitueix una via efectora ràpida i habitual per a la generació de ceramida després de la unió del TNF al seu receptor de membrana. En particular, resultats previs han demostrat que l'esfingomielinasa àcida està implicada en l'apoptosi hepatocel·lular i el dany hepàtic induït pel TNF. Els radicals lliures generats durant la reperfusió i la influència del TNF en el dany hepàtic per isquèmia/reperfusió apunten als esfingolípids com a possibles mediadors. A més, s'han observat increments en els nivells hepàtics de ceramida en processos d'isquèmia freda i reperfusió en calent, tot i que les seves conseqüències i regulació no han estat prèviament caracteritzades. Per altra banda, el factor de transcripció nuclear κB (NF-κB) es coneix com a regulador de vies d'inflamació i de supervivència, és a dir que participa tant en mecanismes protectors com en la generació de citocines inflamatòries, i el balanç d'aquests dos efectes controla finalment el grau de dany hepàtic durant la I/R. S'ha observat que les espècies reactives d'oxigen (ROS) poden interferir en l'activació d'NF-κB, i els ROS juntament amb el TNF s'han descrit com a participants claus en el desenvolupament del dany causat per la I/R hepàtica. De manera que els objectius d'aquest estudi van ser en primer lloc examinarel paper rol de l'esfingomielinasa àcida en l'homeòstasi de la ceramida i la seva contribució en el dany provocat per I/R hepàtica, i en segon lloc ens vàrem proposar analitzar el paper d'NF-κB en la isquèmia/reperfusió.Vàrem observar que durant la I/R hi ha acumulació transitòria de ceramida degut a l'activació seqüencial de l'esfingomielinasa àcida seguit de l'activació de la ceramidasa àcida. També vam demostrar que la generació de ceramida via esfingomielinasa àcida (ASMasa) activa JNK provocant la fosforilació i translocació de BimL a la mitocòndria, i que tant l'administració d'inhibidors farmacològics de l'esfingomielinasa àcida (imipramina), com la regulació a la baixa d'aquest enzim amb ARNs d'interferència disminueixen el dany hepàtic causat per I/R. En definitiva, s'observa que la generació de ceramida via ASMasa contribueix a la mort hepatocel·lular induïda per I/R mitjançant un mecanisme apoptòtic depenent de la mitocòndria, i estratègies encaminades a disminuir la generació de ceramida poden protegir front el dany hepàtic causat per I/R. Paral·lelament, vam observar que l'activació hepàtica d'NF-κB després de la I/R és sensible a l'estat redox cel·lular, i que hi ha una activació diferencial dels gens κB depenents segons el tipus cel·lular: en els hepatòcits, el mecanisme d'activació d'NF-κB és dependent de Src i provoca una subsegüent activació de gens protectors κB depenents, en canvi en les cèl·lules de Kupffer, hi ha una activació canònica d'NF-κB i es transactiven els gens proinflamatoris κB depenents. Vam observar que isquèmies llargues indueixen estrès oxidatiu a l'hepatòcit disminuint l'activació d'NF-κB i l'expressió de gens antiapotòtics com la MnSOD i cIAP, i en canvi, la inactivació de les cèl·lules de Kupffer durant la I/R, disminuïa la producció de gens proinflamatoris κB depenents com TNF i IL-1β. De manera que, vam demostrar que estratègies antioxidants específiques encaminades a disminuir la producció de radicals als hepatòcits pot contribuir no només a reduir l'impacte directe dels radicals en la generació de dany hepàtic, sinó també en el manteniment de l'activació dels gens protectors κB depenents durant la isquèmia/reperfusió