Estudio de la expresión de marcadores de transición epitelio-mesenquimal y de célula madre cancerosa en el melanoma cutáneo, y su asociación con la progresión tumoral

La mayoría de los estudios epidemiológicos muestran un aumento en la incidencia de melanoma en las últimas décadas, sobre todo a expensas de un aumento en la incidencia de melanomas delgados. La búsqueda de nuevos marcadores pronósticos y predictivos incluye el estudio de el fenómeno de transición epitelio-mesenquimal (EMT) que consiste en un proceso dinámico por el que las células adquieren progresivamente un fenotipo mesenquimal, con pérdida de las uniones célula-célula, modificaciones en el citoesqueleto y adquisición de marcadores como cadherina-N, osteonectina/SPARC, osteopontina, fibronectina, Twist y Snail. Por otro lado, en el modelo de tumorigénesis de la célula madre cancerosa (CMC), únicamente las células madre cancerosas, que expresan marcadores como ABCB5, ABCG2, CD34 y CD133, serían capaces de formar tumores, heterogéneos en su composición. En este trabajo de tesis doctoral planteamos la hipótesis de que tanto los marcadores de EMT como de CMC estarían implicados en la progresión tumoral del melanoma cutáneo, y podrían constituir marcadores evolutivos o factores predictivos de la misma. En base a esto, se realizó un estudio con una parte clínica, que incluyó 132 muestras de tumores procedentes de pacientes de el hospital Clínico universitario de Valencia, de las cuales 70 eran tumors primarios (31 delgados y 39 gruesos), y 62 metástasis (18 en tránsito, 27 en ganglios regionales y 17 a distancia) donde se analizó la expresión de los marcadores de interés mediante dos técnicas, la RT-PCR en tiempo real, y la inmunohistoquímica; y una parte experimental, donde se caracterizaron varias líneas celulares y sus xenotrasplantes en ratones inmunodeficientes nude, mediante citometría de flujo. Además, en las muestras de tumores humanos de secuenciaron los genes BRAF y NRAS para determinar la presencia de mutaciones. Se correlacionaron los resultados obtenidos con los factores clinicopatológicos,y con el estado mutacional de BRAF y NRAS. Además, se estudiaron las posibles diferencias en la expresión de los marcadores de interés en las distintas fases de progresión del melanoma, y se correlacionaron con el desarrollo de metástasis, con el intervalo libre de las mismas y con la supervivencia, para proponer modelos predictivos. Los resultados obtenidos permiten concluir que: En el estudio experimental, las líneas de melanoma humano son capaces de inducir el crecimiento tumoral y crear tumores heterogéneos respecto a la expresión de CD133 y otros marcadores de célula madre y EMT, con independencia de la expresión o no de este marcador en las células xenotransplantadas, aunque se observa una mayor velocidad de crecimiento en las células inicialmente CD133+. Una mayor expresión inmunohistoquímica de cadherina-N y osteonectina/SPARC y un aumento de expresión de ARN mensajero de fibronectina, osteonectina/SPARC y osteopontina son características de la fase de crecimiento vertical. La expresión de ARN mensajero de osteopontina (SPP1), cadherina-N (CDH2), FN1, SNAIL-1, SNAIL-2, ON/SPARC, ABCG2 y PROM-1 (CD133) muestra una correlación positiva con el índice de Breslow, mientras que en el estudio inmunohistoquímico sólo la osteopontina y la tinción nuclear para CD34 presentan esta correlación. Por el contrario, la expresión de ARN mensajero de CD34 tiene una correlación negativa con el índice de Breslow. La presencia de ulceración se correlaciona con la expresión inmunohistoquímica de osteonectina/SPARC, fibronectina y CD34 nuclear, y con un mayor nivel de ARN mensajero de ON/SPARC, OP, FN, CDH2, ABCB5, y tiene una correlación negativa con el ARN mensajero de CD34. En cuanto al estudio mutacional, una mayor inmunotinción citoplasmática de ABCB5, ON, OP, y FN se correlaciona con mutaciones en BRAF. En las metástasis está sobreexpresado el ARN mensajero de ABCB5, Cadherina-N, ON/SPARC, OP, FN1, en comparación con los melanomas primarios. Sin embargo, estas diferencias desaparecen cuando se valora exclusivamente la inmunotinción en células tumorales, excepto para CD34 nuclear. El desarrollo de metástasis ganglionares y a distancia se correlaciona con la sobreexpresión de ARNm de FN1, OP(SPP1), ON/SPARC, ABCB5 y ABCG2. Dicha correlación se observa también inmunohistoquímicamente para osteopontina, osteonectina/SPARC, CD133 y CD34 nuclear. El tiempo de supervivencia se ve reducido en los pacientes con una inmunotinción generalizada para ON/SPARC y CD133 en el melanoma primario. La expresión de ARN mensajero de ABCG2, la inmunotinción nuclear para CD34, aunque sea focal, y la inmunotinción generalizada para ON/SPARC en las células tumorales del melanoma primario se asocian a un acortamiento del intervalo libre de metástasis a distancia. La inmunotinción para CD133 en las células tumorales del melanoma primario se correlaciona positivamente con una mayor capacidad metastásica, y particularmente cuando la tinción es intensa. El estudio de esta variable incrementa además el valor predictivo de los parámetros clásicos (índice de Breslow y ulceración)

Utilización de Kahoot! en las clases teóricas de Anatomía Patológica: mejorando la motivación e interacción en la docencia virtual

[EN] Faced with the COVID-19 pandemic situation, education has had to adapt to online teaching, trying to preserve the essential student-teacher interaction. In this project we used the interactive tool Kahoot! in the theory lectures of Special Anatomical Pathology of the Degree in Medicine, which were fully taught online. The games consisted of questions about the lesson´s contents, to strengthen learning and self-evaluation. After playing Kahoot!, results were discussed to highlight important concepts and explain doubts. The perception of the students was evaluated through an online survey. The results indicate that using Kahoot! in the theory classes has been very satisfactory and has encouraged students to attend class. Students consider that this tool increases interaction, helps them understand the topics and will facilitate studying. It is also an easy-to-use tool, and the results can serve as a supplementary assessment. In conclusion, we consider that Kahoot! contributes to improve interaction and learning in synchronous online theory lectures.[ES] Ante la situación de pandemia por COVID-19, la docencia ha tenido que adaptarse a la enseñanza online intentando preservar la esencial interacción entre el alumno y el profesor. En este proyecto se planteó la utilización de la herramienta interactiva Kahoot! en las clases teóricas de Anatomía Patológica Especial del grado de Medicina, que se impartieron íntegramente online. Los cuestionarios constaban de preguntas sobre el contenido de la clase, para reforzar el aprendizaje y la autoevaluación. Tras realizar el Kahoot! se comentaban los resultados para resaltar conceptos importantes y aclarar dudas. La percepción de los estudiantes se evaluó mediante una encuesta online. Los resultados indican que la utilización de Kahoot! en las clases teóricas ha resultado muy satisfactoria y ha animado a los estudiantes a asistir a clase. Los estudiantes consideran que esta herramienta mejora la interacción, les ayuda a comprender los contenidos y les facilitará el estudio. Se trata además de una herramienta fácil de utilizar, y los resultados pueden servir como complemento a la evaluación. En conclusión, consideramos que la incorporación de Kahoot! contribuye a mejorar la interacción y el aprendizaje en las clases teóricas online síncronas.A todos los alumnos participantes de la asignatura Anatomía Patológica Especial del curso 2020-2021. Este proyecto ha sido financiado en el marco de las “Ajudes per al Desenvolupament de Projectes d’Innovació Educativa del curso 2020-2021” del Vicerectorat d’Ocupació i Programes Formatius de la Universitat de València (Código del proyecto: UV-SFPIE_PID20-1353524).Alfaro-Cervelló, C.; Terrádez-Mas, L. (2021). Utilización de Kahoot! en las clases teóricas de Anatomía Patológica: mejorando la motivación e interacción en la docencia virtual. En IN-RED 2021: VII Congreso de Innovación Edicativa y Docencia en Red. Editorial Universitat Politècnica de València. 563-574. https://doi.org/10.4995/INRED2021.2021.13793OCS56357

Progastrin Represses the Alternative Activation of Human Macrophages and Modulates Their Influence on Colon Cancer Epithelial Cells

Macrophage infiltration is a negative prognostic factor for most cancers but gastrointestinal tumors seem to be an exception. The effect of macrophages on cancer progression depends on their phenotype, which may vary between M1 (pro-inflammatory, defensive) to M2 (tolerogenic, pro-tumoral). Gastrointestinal cancers often become an ectopic source of gastrins and macrophages present receptors for these peptides. The aim of the present study is to analyze whether gastrins can affect the pattern of macrophage infiltration in colorectal tumors. We have evaluated the relationship between gastrin expression and the pattern of macrophage infiltration in samples from colorectal cancer and the influence of these peptides on the phenotype of macrophages differentiated from human peripheral monocytes in vitro. The total number of macrophages (CD68+ cells) was similar in tumoral and normal surrounding tissue, but the number of M2 macrophages (CD206+ cells) was significantly higher in the tumor. However, the number of these tumor-associated M2 macrophages correlated negatively with the immunoreactivity for gastrin peptides in tumor epithelial cells. Macrophages differentiated from human peripheral monocytes in the presence of progastrin showed lower levels of M2-markers (CD206, IL10) with normal amounts of M1-markers (CD86, IL12). Progastrin induced similar effects in mature macrophages treated with IL4 to obtain a M2-phenotype or with LPS plus IFNγ to generate M1-macrophages. Macrophages differentiated in the presence of progastrin presented a reduced expression of Wnt ligands and decreased the number and increased cell death of co-cultured colorectal cancer epithelial cells. Our results suggest that progastrin inhibits the acquisition of a M2-phenotype in human macrophages. This effect exerted on tumor associated macrophages may modulate cancer progression and should be taken into account when analyzing the therapeutic value of gastrin immunoneutralization

Intracellular coexpression of CXC- and CC– chemokine receptors and their ligands in human melanoma cell lines and dynamic variations after xenotransplantation

BackgroundChemokines have been implicated in tumor progression and metastasis. In melanoma, chemokine receptors have been implicated in organ selective metastasis by regulating processes such as chemoattraction, adhesion and survival.MethodsIn this study we have analyzed, using flow cytometry, the systems formed by the chemokine receptors CXCR3, CXCR4, CXCR7, CCR7 and CCR10 and their ligands in thirteen human melanoma cell lines (five established from primary tumors and eight established from metastasis from different tissues). WM-115 and WM-266.4 melanoma cell lines (obtained from a primary and a metastatic melanoma respectively) were xenografted in nude mice and the tumors and cell lines derived from them were also analyzed.ResultsOur results show that the melanoma cell lines do not express or express in a low degree the chemokine receptors on their cell surface. However, melanoma cell lines show intracellular expression of all the aforementioned receptors and most of their respective ligands. When analyzing the xenografts and the cell lines obtained from them we found variations in the intracellular expression of chemokines and chemokine receptors that differed between the primary and metastatic cell lines. However, as well as in the original cell lines, minute or no expression of the chemokine receptors was observed at the cell surface.ConclusionsCoexpression of chemokine receptors and their ligands was found in human melanoma cell lines. However, this expression is intracellular and receptors are not found at the cell membrane nor chemokines are secreted to the cell medium. The levels of expressed chemokine receptors and their ligands show dynamic variations after xenotransplantation that differ depending on the origin of the cell line (from primary tumor or from metastasis)

Characteristics of patients and tumors.

<p>Characteristics of patients and tumors.</p

Influence of progastrin on human M1 and M2 macrophages.

<p>Human monocyte-derived macrophages were stimulated with LPS plus IFNγ to obtain a M1-phenotype or with IL4 to obtain M2-macrophages in the presence or absence of progastrin, and the resultant phenotype evaluated by analyzing the following parameters: expression of CD86 (A, n = 3); expression of CD206 (B, n = 5); secretion of IL10 (C, D, n = 5); and secretion of IL12 (E, F, n = 5). Bars represent mean ±SEM. *P<0.05 vs corresponding value in vehicle-treated cells; ⁺ P<0.05 and ⁺⁺P<0.01 vs corresponding value in control cells.</p

Influence of progastrin-treated macrophages on colorectal cancer cells.

<p>The effects of human monocyte-derived macrophages obtained in the presence or absence of progastrin on the number (A) and the rate of apoptosis (B) of Caco-2 cells were analyzed in a co-culture system (24 h, n = 4). Bars represent mean ±SEM. *P<0.05 vs corresponding value in vehicle-treated macrophages, ⁺P<0.05 and ⁺⁺P<0.01 vs cells incubated with an empty insert (w/o MF).</p

Pattern of macrophage infiltration in colorectal cancer and healthy surrounding tissues.

<p>The immunoreactivity to CD68 (MF marker, A–B), CD86 (M1-MF marker, C–D) and CD206 (M2-MF marker, E–F) was analyzed in colorectal cancer (B, D, F) and healthy surrounding mucosa (A, C, E). (G) Quantitative analysis of positive cells for these molecules in a representative area of 0.22 mm² (Scale bar  = 0.2 mm). Bars represent mean ±SEM (n = 21). **P<0.01 and ***P<0.001 vs corresponding value in normal mucosa.</p

Antibodies used in immunohistochemistry (IHC) and static cytometry studies.

<p>*Procedure to unmask the antigen.</p