Identifizierung neuer Kerndomänen assoziierter Proteine

Der Zellkern eukaryotischer Zellen zeichnet sich durch zahlreiche morphologisch sowie funktionell unterschiedliche Domänen aus, die als Kernkompartimente bezeichnet werden. Zu ihnen gehören u. a. der Nukleolus und die Promyelozytische Leukämie (PML) Protein Kerndomänen, die als dynamische subnukleäre Strukturen bei der Regulation des Zellzyklus, der Apoptose, der Transkription, der Tumorsuppression und der zellulären, antiviralen Antwort eine wichtige Bedeutung besitzen. Die Funktion sowie die Regulation der in Kerndomänen ablaufenden Prozesse sind gegenwärtig weitgehend nur unzureichend verstanden. Ziel dieser Dissertation war es, neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der Funktion von Kerndomänen beitragen. Zu diesem Zweck wurden neue, nicht charakterisierte proteinkodierende Abschnitte von in Sequenzdatenbanken bis zu diesem Zeitpunkt nicht annotierten cDNAs an EYFP fusioniert, in humanen Zelllinien exprimiert und auf ihre subzelluläre Lokalisation analysiert. Zwei dieser neuen Proteine konnten aufgrund ihrer Lokalisation als neue Kerndomänen-assoziierte Komponenten identifiziert werden. Bei einem der beiden Proteine, dem PAROT (PML-associated repressor of transcription)-Protein, handelt es sich um einen Repressor der Transkription, der eine N-terminale Repressordomäne, eine KRAB- (Krüppel associated box) Domäne, eine Linker-Domäne und eine C-terminale C2H2-Zinkfinger (ZNF)-Domäne zur DNA-Bindung, sowie drei Konsensus- Kernlokalisationssignale (NLS) besitzt. Anhand seiner Domänenstruktur konnte PAROT der ZNF91-Proteinfamilie der „multiple-adjacent“-KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteine zugeordnet und das zugehörige Gen, ebenso wie die meisten anderen Mitglieder der ZNF91-Proteinfamilie, auf dem Chromosom 19p13.11 kartiert werden. Die PAROT mRNA konnte in verschiedenen menschlichen Geweben wie Skelettmuskel, Niere, Dickdarm und Gehirn als ein 4.4 kb Transkript nachgewiesen werden. Ektopisch exprimiertes PAROT-Protein lokalisiert in Kerndomänen und kann durch die PML-Isoform IV in PML-Kerndomänen rekrutiert werden. Weiterhin kolokalisiert es mit dem Korepressor TIF1b sowie mit Mitgliedern der Heterochromatin Protein 1 (HP1)-Proteinfamilie, was vermuten lässt, dass das PAROT-Protein, ähnlich wie andere KRAB-ZNF Repressoren, über die direkte Interaktion mit TIF1b die Genexpression reprimiert. Die Repression der Transkription durch das PAROT-Protein kann aufgrund der Rekrutierung durch die PML-Isoform PML IV in PML-Kerdomänen dosisabhängig aufgehoben werden. Somit handelt es sich bei PAROT um einen durch seine Assoziation mit PML-Kerndomänen regulierbaren Transkriptionsrepressor. Indirekte Immunfluoreszenzanalysen mit unterschiedlichen gegen das PAROT-Protein gerichteten Antikörpern zeigten unerwarteterweise eine Kolokalisation von PAROT mit Mitochondrien, was als Hinweis verstanden werden kann, dass PAROT nur auf bestimmte Stimuli hin in den Zellkern einwandert und seine Zielgene reprimiert. Das zweite identifizierte Kerndomänenprotein, Nucleostatmin, besitzt zwei putative NLS, eine mögliche Nukleoluslokalisierungssequenz (NoLS) und ein RNA-Erkennungsmotiv (RRM), das dieses Protein als ein RNA-bindendes Protein klassifiziert. Nucleostatmin ist ein in Maus und Ratte konserviertes Protein und zeigt eine starke Sequenzhomologie zum Protein aus Maus und Ratte, die besonders in den Bereichen des RRM und der möglichen NoLS ausgeprägt sind. Ektopisch exprimiertes Nucleostatmin lokalisierte überwiegend im Nukleoplasma, war jedoch auch im Nukleolus nachweisbar. Endogenes Nucleostatmin Protein ist zusammen mit der DNA-abhängigen RNA Polymerase I und dem UBF Protein in fibrillären Zentren des Nukleolus lokalisiert. Wurde die DNA-abhängige RNA-Synthese der RNA Pol I durch AMD inhibiert, lokalisierte Nucleostatmin nicht mehr im Nukleolus, sondern war diffus im Nukleoplasma verteilt. Demnach übt Nucleostatmin möglicherweise eine Funktion auf transkriptioneller oder post-transkriptioneller Ebene der rRNA Transkription aus. Zwei neue, unbekannte Kerndomänen-assoziierten Proteine konnten mithilfe dieses methodischen Lösungsansatzes identifiziert und charakterisiert wurden. Es stellte sich im Laufe dieser Arbeit heraus, dass dabei die Lokalisation der EYFP-Fusionsproteine nicht zwingend der des endogenen Proteins entspricht, was erstmals eine Schwachstelle dieses Ansatzes zur Identifizierung neuer Kerndomänenkomponenten aufzeigt. Dennoch bestätigte sich für PAROT als ersten Vertreter der KRAB-C2H2-Zinkfinger Proteinfamilie nachweislich eine PML-Kerndomänen Assoziation. Interessanterweise wurde auch ein weiteres KRAB-C2H2-Zinkfinger, KRIM1A, von PML IV in PML-Kerndomänen rekrutiert. Eine PML-Kerndomänen Assoziation von Nucleostatmin bleibt zu analysieren. Mit großer Wahrscheinlichkeit handelt es sich hierbei um ein neues RNA-bindendes, nukleoläres Protein, das eine noch unbekannte Funktion in der rRNA Transkription ausübt

Funktionelle Bedeutung von VCAM-1 und CD4+ T-Zellen fuer die Induktion einer protektiven Immunantwort bei der murinen Toxoplasmose

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des Zelladhaesionsmolekuels VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) bei der Toxoplasmose, und damit erstmals bei einer murinen Infektionskrankheit, analysiert. Dazu wurden VCAMflox/flox MxCre Maeuse verwendet, in denen das VCAM-1-Gen durch eine IFN-alpha induzierbare Cre loxP-abhaengige Deletion neonatal ausgeschaltet war. Dies fuehrte zu einer fehlenden Induktion von VCAM-1 auf den Endothelzellen zerebraler Blutgefaesse. Die konstitutive Expression von VCAM-1 auf dem Epithelzellen des Plexus choroideus und dem Ependym der Gehirnkammern war dagegen nicht betroffen. Die Resistenz gegen Toxoplasma gondii in VCAMflox/flox MxCre Maeusen war stark beeintraechtigt. So verstarben VCAM-1-defiziente Maeuse an einer chronischen Toxoplasma Enzephalitis (TE) aufgrund einer unzureichenden, zerebralen Erregerkontrolle. Entgegen der Erwartung war die Rekrutierung der Leukozyten unveraendert. Dagegen zeigten VCAMflox/flox MxCre Maeuse eine Reduktion in der Produktion T.gondii-spezifischer Antikoerper sowie in der Frequenz und im Aktivierungsstatus intrazerebraler, T.gondii-spezifischer T-Zellen. Auch die Makrophagen- und Mikrogliaaktivierung war deutlich verringert. In dieser Arbeit wurde ausserdem die Rolle der CD4+ T-Zellen bei der Induktion einer T.gondii-spezifischen Immunantwort in CD4-depletierten, T.gondii-resistenten Maeusen, die keine CD4+ T-Zellen besitzen, untersucht. Als Vergleich dienten nicht-depletierte Kontrolltiere. Wurden CD4-depletierte Maeuse mit beta-Galaktosidase-exprimierenden Toxoplasmen infiziert, entwickelten sie eine nekrotisierende TE und verstarben bis zum Tag 28 nach Infektion, waehrend nicht-depletierte Tiere ueberlebten. Die Frequenz und der Aktivierungsstatus beta-Galaktosidase-spezifischer CD8+ T-Zellen war in CD4-depletierten, T.gondii-resistenten Maeusen nicht beeintraechtigt. Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen der Milz und des Gehirns aus CD4-depletierten Tieren produzierten ausserdem IFN-gamma und TNF-alpha und waren zytotoxisch aktiv. Diese Funktionen der CD8+ T-Zellen waren in depletierten Maeusen im Gehirn jedoch geringfuegig reduziert. Die Aktivierung zerebraler Makrophagen und Mikroglia, die durch die MHC Kl. II-Expression und TNF-alpha Produktion ermittelt wurde, war in CD4-depletierten Maeusen nicht vermindert. Dagegen war die Produktion T.gondii-spezifischer Antikoerper im Serum CD4-depletierter Maeuse im Vergleich zur Kontrollgruppe stark reduziert. Im Liquor fuehrte die CD4-Depletion zum voelligen Verlust T.gondii-spezifischer IgG und IgM Antikoerper. Die Behandlung mit T.gondii-antikoerperhaltigem Immunserum konnte die Resistenz CD4-depletierter Maeuse gegen T.gondii verbessern und die Ueberlebensrate deutlich erhoehen. Die funktionelle Bedeutung von CD4+ T-Zellen fuer die Induktion einer T.gondii-spezifischen Antikoerperantwort wurde auch in T.gondii-suszeptiblen, MHC Kl. II-defizienten Maeusen, denen konventionelle CD4+ T-Zellen fehlen, sowie in T.gondii-suszeptiblen, CD4-depletierten Maeusen nachgewiesen. Aehnlich wie in T.gondii-resistenten Maeusen, wiesen infizierte T.gondii-suszeptible Maeuse eine erheblich Reduktion der T.gondii-spezifischen Antikoerper auf. Durch die Behandlung mit T.gondii-spezifischen Antikoerpern von MHC Kl. II-defizienten Maeusen konnte die eingeschraenkte Resistenz temporaer ueberwunden werden. Im Gegensatz zur B-Zellantwort war die Induktion einer CD8+ T-Zellantwort in T.gondii-suszeptiblen Maeusen von CD4+ T-Zellen unabhaengig. Die Untersuchung von nicht-konventionellen, T.gondii-spezifischen CD4+ T-Zellen aus MHC Kl. II-defizienten Maeusen ergab, dass diese trotz der CD1-abhaengigen IFN-gamma Produktion, nicht zum Schutz gegen T.gondii beitragen. Ausserdem war sowohl die Induktion einer T.gondii-spezifischen Antikoerperantwort als auch die Induktion einer T.gondii-spezifischen CD8+ T-Zellantwort von nicht-konventionellen CD4+ T-Zellen unabhaengig. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass VCAM-1 und CD4+ T-Zellen fuer die Kontrolle des intrazellulaeren Parasiten T.gondii von entscheidender Bedeutung sind. Waehrend VCAM-1 sowohl fuer die Induktion einer T.gondii-spezifischen Antikoerperantwort als auch fuer eine effektive T-Zellantwort und Makrophagen/Mikrogliaaktivierung verantwortlich ist, koennen andere Zelladhaesionsmolekuele die VCAM-1-abhaengige Rekrutierung ueber die zerebralen Blutgefaesse effektiv kompensieren. Auch die Funktion von CD4+ T-Zellen besteht darin eine T.gondii-spezifische Antikoerperantwort zu induzieren. Im Gegensatz zu VCAM-1 sind CD4+ T-Zellen an der Induktion einer T.gondii-spezifischen CD8+ T-Zellantwort nur unwesentlich beteiligt und spielen keine Rolle bei der Makrophagen- und Mikrogliaaktivierung

Plasmodium falciparum: Funktionelle Analyse von Proteinen des sekretorischen Transportweges in transfizierten Zellen

In erythrozytären Entwicklungsstadien von Plasmodium falciparum werden Parasitenproteine zu verschiedenen Kompartimenten innerhalb des Parasiten transportiert sowie in die Wirtszelle exportiert und stehen in direktem Zusammenhang mit der schweren klinischen Symptomatik der Malaria tropica. Der Transport der meisten Parasitenproteine wird durch die Gegenwart von Brefeldin A (BFA) inhibiert. Die Zielstruktur von BFA ist die konservierte Sec7 Domäne der Arf-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (Arf-Gef), die für die Aktivierung von Arf (ADP-Ribosylierungsfaktor) und für die Ausbildung von COP I-Transportvesikeln notwendig ist. Über double cross-over Gen-Austausch in P. falciparum konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine Punktmutation innerhalb der Sec7 Domäne ausreichend ist, um BFA-Resistenz der Parasiten zu begründen. Es wurden Komplementations-Studien in der Hefe S. cerevisiae durchgeführt, die einen intermediären Phänotyp hervorbrachten und darauf hindeuten, dass das P. falciparum Arf-Gef möglicherweise als GDP-GTP-Austausch-Protein in ER-/Golgi-Transportprozessen funktioniert. In der Sec7 Region des PfArf-Gef existiert eine ungewöhnlich lange Einschubsequenz, deren Bedeutung in der Hefe und in silico untersucht wurde. Exportierte Parasitenproteine, die beispielsweise in die Kompartimente des Apikalkomplexes oder in den Apikoplast transportiert werden, besitzen meist N-terminale ER-Signalsequenzen, während viele der in die Wirtszelle transportierten Proteine interne hydrophobe Regionen besitzen, von denen angenommen wird, dass sie als ?ungewöhnliche? ER-Signalsequenzen fungieren könnten. Die interne hydrophobe Region von PfGbp130 (glycophorine binding protein) und verkürzte Varianten dieses Bereiches sowie die experimentell charakterisierte Signalsequenz von Exp-1 wurden in der Hefe S. cerevisiae als ER-Signalsequenzen getestet und erwiesen sich als nicht funktionell. Möglicherweise existieren ungewöhnliche oder verschiedene sekretorische Wege in P. falciparum, die in heterologen Systemen nicht rekonstituiert werden können. In dieser Arbeit wurden zwei Teilaspekte der sekretorischen Prozesse in P. falciparum untersucht. Die Identifizierung und molekulare Analyse weiterer Mediatormoleküle im Proteintransport des Parasiten sind notwendig, um ein möglichst komplettes Bild über die sekretorischen Abläufe entwerfen zu können

Untersuchungen zur Topologie der Glycosylphosphatidylinositol-Biosynthese in Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren

An alternative secretory pathway in the malaria parasite Plasmodium falciparum

The malaria parasite P. falciparum invades human red blood cells (RBCs). During invasion a compartment surrounding the parasite, the so-called parasitophorous vacuole (PV), is formed. The parasite resides and develops within the PV, which protects the parasite from the host cell cytosol. During its intraerythrocytic growth the parasite exports a vast number of proteins to the host cell in order to maintain its survival within the RBC. Proteins, which are directed to the host cell cytosol and host cell membrane, respectively, therefore are challenged to cross the parasite plasma membrane, the PV and the parasitophorous vacuolar membrane (PVM). However, the secretion and export mechanisms of many parasite proteins are still not understood. The current study focuses on the discovery of an alternative secretory pathway to the ER/Golgi route in the malaria parasite P. falciparum in infected RBCs. Two proteins appeared to be promising candidates of an alternative secretory pathway: the PfADPribosylation factor 1 (ARF1) and the Pfadenylate kinase 2 (AK2). Both proteins contained a N-myristoylation site at their N-terminus, which is indicative for Nmyristoylation. N-myristoylation is a co-translational modification of a protein, whereby a fatty acid (myristate) is irreversibly attached to the glycine residue at the N-terminus of a protein via the PfN-myristoyltransferase (NMT). A preceding proteomic analysis of the parasitophorous vacuole and a reporter construct study proposed for both PfARF1 (determined by a proteomic study) and PfAK2 (determined by a reporter construct study) PV localization although both proteins lacked a signal peptide. That’s why it was hypothesized whether or not N-myristoylation would drive protein secretion across the parasite plasma membrane (PPM). The subcellular localization of the PfARF1/GFP parasites and the PfAK2/GFP parasites, respectively, were analyzed via epifluorescence microscopy and biochemical methods. In parallel, another batch of reporter constructs were generated and analyzed, where the N-myristoylation site of PfARF1 (this study) and PfAK2 (Ma et al., 2012), respectively, was removed (PfARF1G2A/GFP and PfAK2G2A/GFP). Live cell imaging showed that the fusion protein ARF1/GFP was localized as dot-like structures in the parasite. In contrast, the phenotype of the fusion protein of the PfARF1G2A/GFP parasites showed an evenly distributed signal in the parasite cytosol. Further analysis of the subcellular localization of the PfARF1 strongly supports its localization to compartments of the early secretory pathway of the parasite, but no localization in the PV. In contrast, the fusion protein PfAK2/GFP localized to a ring-like structure around the parasite indicating PV localization. The PfAK2G2A/GFP parasites showed a cytosolic localization of the fusion protein (Ma et al., 2012). Biochemical analyses revaled that the fusion protein PfAK2/GFP was secreted into the PV when the N-myristoylation site was present. Furthermore, it could be shown that the N-terminus of the PfAK2 protein is sufficient for parasite plasma membrane targeting, stable membrane anchoring and subsequent protein translocation across the PPM. A possible role of the early secretory pathway in PfAK2 trafficking and the folding state of PfAK2 prior to translocation across the PPM was also examined. However, the exact mechanism how PfAK2 is translocated across the PPM still remains elusive

Die biochemische Analyse des Plasmodium falciparum Zytoadhärenz Moleküls PfEmp1 zeigt einen potentiell neuen Mechanismus für die Insertion von Oberflächenproteinen in Membranen

Das 1995 entdeckte Plasmodium falciparum Zytoadhärenz-Molekül PfEmp1 wird auf der Oberfläche von infizierten Erythrozyten exponiert und ist ein wichtiger Pathogenitätsfaktor in Malaria. PfEmp1-Proteine bilden eine hoch-variable Antigenfamilie, die dem intraerythrozytären Parasiten die Immunevasion ermöglicht. In der allgemeinen Vorstellung wird PfEmp1, das eine zum C-Terminus proximale hydrophobe Region besitzt, als Typ 1-Membranprotein synthetisiert und als solches in die Erythrozytenmembran sezerniert. Dieses Modell setzt einen Protein-Sekretionsapparat, wie er in allen kernhaltigen eukaryoten Zellen vorhanden ist, in der Wirtszelle voraus. Erythrozyten sind jedoch weder zu der Synthese noch zu dem Transport von Proteinen fähig. Dieses Problem wurde in dem vorliegenden Projekt zum Anlass genommen, das Modell einer genauen biochemischen Überprüfung zu unterziehen. Das Protein konnte nach Behandlung von infizierten Erythrozyten mit dem Sekretions-Inhibitor BFA im Parasiten akkumuliert werden und ließ sich dort mit alkalischem Karbonatpuffer im Gegensatz zu einem integralen Marker-Membranprotein extrahieren. Es wurde ein Verfahren zur Untersuchung von Transportvesikeln entwickelt, jedoch konnte die Assoziation von PfEmp1 mit solchen nicht gezeigt werden. Stattdessen war das Protein, einmal in die Wirtszelle sezerniert, unter Bedingungen, unter denen integrale Membranproteine unlöslich sind, löslich. PfEmp1-Moleküle, die in die Erythrozytenmembran inseriert waren, konnten mit Harnstoff extrahiert werden. Integrale Marker-Membranproteine waren resistent gegen die Harnstoffbehandlung, und in Saccharose-Dichtegradienten konnte Oberflächen-PfEmp1 nach Harnstoffbehandlung von Membranproteinen des Erythrozyten getrennt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeichnen ein neues Bild von der Membranassoziation von PfEmp1 und deuten auf einen gänzlich verschiedenen Mechanismus der Sekretion und der Membraninsertion hin. Das Protein wird vermutlich als peripheres Membranprotein oder als Teil eines Komplexes sezerniert und über einen unbekannten Mechanismus, der die spezifische Interaktion von PfEmp1 mit Protein-Bindungspartnern impliziert, in die Erythrozytenmembran inseriert. Dort steht PfEmp1 im Verband mit anderen Proteinen, ohne selber direkt mit Lipiden wechselzuwirken

The 54-kD Protein of Signal Recognition Particle Contains a Methionine-rich RNA Binding Domain

Signal recognition particle (SRP) plays the key role in targeting secretory proteins to the membrane of the endoplasmic reticulum (Walter, P., and V. R. Lingappa. 1986. Annu. Rev. CeliBiol. 2:499-516). It consists of SRP7S RNA and six proteins. The 54-kD protein of SRP (SRP54) recognizes the signal sequence of nascent polypeptides. The 19-kD protein of SRP (SRP19) binds to SRP7S RNA directly and is required for the binding of SRP54 to the particle. We used deletion mutants of SRP19 and SRP54 and an in vitro assembly assay in the presence of SRP7S RNA to define the regions in both proteins which are required to form a ribonucleoprotein particle. Deletion of the 21 COOH-terminal amino acids of SRP19 does not interfere with its binding to SRP7S RNA. Further deletions abolish SRP19 binding to SRP7S RNA. The COOH-terminal 207 amino acids of SRP54 (M domain) were found to be necessary and sufficient for binding to the SRP19/7S RNA complex in vitro. Limited protease digestion of purified SRP confirmed our results for SRP54 from the in vitro binding assay. The SRP54M domain could also bind to Escherichia coli 4.5S RNA that is homologous to part of SRP7S RNA. We suggest that the methioninerich COOH terminus of SRP54 is a RNA binding domain and that SRP19 serves to establish a binding site for SRP54 on the SRP7S RNA

The evolutionary dynamics of variant antigen genes in Babesia reveal a history of genomic innovation underlying host-parasite interaction

Babesia spp. are tick-borne, intraerythrocytic hemoparasites that use antigenic variation to resist host immunity, through sequential modification of the parasite-derived variant erythrocyte surface antigen (VESA) expressed on the infected red blood cell surface. We identified the genomic processes driving antigenic diversity in genes encoding VESA (ves1) through comparative analysis within and between three Babesia species, (B. bigemina, B. divergens and B. bovis). Ves1 structure diverges rapidly after speciation, notably through the evolution of shortened forms (ves2) from 5′ ends of canonical ves1 genes. Phylogenetic analyses show that ves1 genes are transposed between loci routinely, whereas ves2 genes are not. Similarly, analysis of sequence mosaicism shows that recombination drives variation in ves1 sequences, but less so for ves2, indicating the adoption of different mechanisms for variation of the two families. Proteomic analysis of the B. bigemina PR isolate shows that two dominant VESA1 proteins are expressed in the population, whereas numerous VESA2 proteins are co-expressed, consistent with differential transcriptional regulation of each family. Hence, VESA2 proteins are abundant and previously unrecognized elements of Babesia biology, with evolutionary dynamics consistently different to those of VESA1, suggesting that their functions are distinct

The Plasmodium Export Element Revisited

We performed a bioinformatical analysis of protein export elements (PEXEL) in the putative proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. A protein family-specific conservation of physicochemical residue profiles was found for PEXEL-flanking sequence regions. We demonstrate that the family members can be clustered based on the flanking regions only and display characteristic hydrophobicity patterns. This raises the possibility that the flanking regions may contain additional information for a family-specific role of PEXEL. We further show that signal peptide cleavage results in a positional alignment of PEXEL from both proteins with, and without, a signal peptide

Fosmidomycin Uptake into Plasmodium and Babesia-Infected Erythrocytes Is Facilitated by Parasite-Induced New Permeability Pathways

., a mouse malaria parasite. and related parasites. Our data provide further evidence that parasite-induced new permeability pathways may be exploited as routes for drug delivery