Legal and methodological aspects of genetic diagnostic tests used to select cancer patients to molecularly targeted therapies

Wprowadzenie w onkologii nowych terapii ukierunkowanych molekularnie spowodowało powstanie wielu laboratoriów,które zajmują się wykrywaniem somatycznych mutacji w komórkach nowotworowych, na podstawie którychkwalifikuje się chorych do różnych rodzajów leczenia. Funkcjonowanie takich laboratoriów powinno być regulowaneprzez ścisłe przepisy prawne uwzględniające sposoby ich zarządzania, wymogi personalne i lokalowe oraz wyposażeniew certyfikowaną aparaturę, a testy genetyczne stosowane w diagnostyce in vitro powinny zawierać znak CE/IVD.Niestety, polskie laboratoria genetyczne, z powodu braku rozwiązań związanych z finansowaniem terapeutycznychprogramów lekowych w chorobach nowotworowych, działają często niezgodnie z niektórymi przepisami. Równocześniew ostatnich latach rozwinęły się nowe techniki biologii molekularnej i cytogenetyki (real-time PCR, FISH), którew łatwy i coraz tańszy sposób umożliwiają wiarygodne wykrycie takich zaburzeń genetycznych, jak mutacje w eksonach18–21 genu EGFR, określające grupę chorych, u których stosuje się inhibitory kinazy EGFR w niedrobnokomórkowymraku płuca, mutacje w kodonach 12, 13 i 61 genu KRAS związane z małą skutecznością przeciwciał anty-EGFR w rakujelita grubego czy nadmierna liczba kopii genu HER2 warunkująca skuteczność terapii anty-HER2 w raku piersi.Introduction of novel molecularly targeted therapies resulted in rapid development of diagnostic laboratories focusedon detection of somatic mutations in tumour cells that allow selection of patients to particular treatments. Suchlaboratories should function according to strict legislation, including their management, working space, personnelrequirements and certified equipment, and use genetic tests dedicated to in vitro diagnostics (CE/IVD marking). Unfortunately,several Polish genetic laboratories do not meet these requirements, mainly owing to the lack of financingmechanisms for therapeutic drug programs in cancer. At the same time, new reliable techniques of molecular andcytogenetic diagnostics, such as real-time PCR and FISH have been developed. These methods provide simpler andcheaper means of detecting several genetic abnormalities, such as exon 18–21 mutations of EGFR gene, defininggroup of non-small cell lung cancer patients who benefit from EGFR tyrosine kinase inhibitors mutations in codons12, 13 and 61 of KRAS gene, associated with lower effectiveness of anti-EGFR antibodies in colorectal cancer, orHER2 gene amplification, predictive of the efficacy of anti-HER2 therapies in breast cancer

Postać dziedziczna choroby prionowej w Polsce

Background and purpose The aim of the study was to perform molecular analysis in a group of patients affected with prion disease. Diagnosis was based on results of clinical and/or histopathological examination of the brain. This is the largest investigation of this type performed so far in Poland. Material and methods Analysed material contained 36 cases of prion disease, including 35 cases of Creutzfeldt-Jakob disease and one case of Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease, as well as two familial cases initially suspected of Huntington disease and Alzheimer disease. The control group consisted of 87 subjects. The most frequent known mutations in the PRNP gene were looked for, namely those in codons 102, 117, 178, 200, 217 and OPRI; the polymorphism Met/Val in codon 129 was also analysed. The methods applied were PCR-RFLP and DNA sequencing. Results The following mutations were found: E200K in 5 families, P102L in one family (previously identified), D178N in one family and 6OPRI in one family. Overall, mutations were detected in 17 persons (including 8 preclinical ones) from 8 pedigrees. Highly significant difference of codon 129 Met/Val heterozygosity frequencies was found between the affected subjects and the controls. Frequency of the familial form of prion disease in the material analysed was 14%. Conclusions Screening for mutations in the PRNP gene should be performed in all diagnosed cases of prion disease and cases of familial occurrence of early onset dementia of unknown aetiology. Families with identified mutations should be offered genetic counselling and informed of risks of blood and organs’ donation.Wstęp i cel pracy Celem pracy była analiza molekularna w grupie osób dotkniętych chorobą prionową, rozpoznaną na podstawie objawów klinicznych i/lub wyniku badania neuropatologicznego mózgu. Było to największe tego typu badanie przeprowadzone dotychczas w Polsce. Materiał i metody W skład analizowanego materiału weszło 36 przypadków choroby prionowej, w tym 35 przypadków choroby Creutzfeldta-Jakoba i jeden przypadek choroby Gerstmanna-Sträusslera-Scheinkera, a także dwa przypadki rodzinne podejrzane o chorobę Huntingtona i chorobę Alzheimera oraz grupa kontrolna (87 osób). Poszukiwano najczęstszych mutacji w genie PRNP: wkodonach 102, 117, 178, 200, 217 i OPRI. Kodon 129 analizowano również pod kątem zygotyczności (walina/metionina). Stosowano metodę PCR-RFLP i sekwencjonowanie. Wyniki Wykryto mutacje: E200K – pięć rodzin, P102L – jedna rodzina (wcześniej zidentyfikowana), D178N – jedna rodzina, 6OPRI – jedna rodzina. Łącznie stwierdzono mutację w 8 rodowodach u 17 osób, w tym u 8 osób w fazie przedobjawowej. Zaobserwowano także bardzo istotną różnicę w częstości występowania heterozygotyczności Met/Val pomiędzy grupą badaną i grupą kontrolną. Częstość dziedzicznej postaci choroby prionowej w analizowanym materiale wynosi 14%. Wnioski Mutacji w genie PRNP należy poszukiwać we wszystkich przypadkach choroby prionowej oraz w przypadkach rodzinnie występującego otępienia o wczesnym początku i niewyjaśnionej etiologii. Przebieg kliniczny i zmiany neuropatologiczne w niektórych przypadkach dziedzicznych chorób prionowych mogą się różnić od spotykanych najczęściej w sporadycznej postaci choroby. Rodziny ze stwierdzoną mutacją winny być objęte poradnictwem genetycznym i poinformowane o zagrożeniu związanym z dawstwem krwi i narządów do przeszczepienia

c.1810C>T Polymorphism of NTRK1 Gene is associated with reduced Survival in Neuroblastoma Patients

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>TrkA (encoded by <it>NTRK1 </it>gene), the high-affinity tyrosine kinase receptor for neurotrophins, is involved in neural crest cell differentiation. Its expression has been reported to be associated with a favourable prognosis in neuroblastoma. Therefore, the entire coding sequence of <it>NTRK1 </it>gene has been analysed in order to identify mutations and/or polymorphisms which may alter TrkA receptor expression.</p> <p>Methods</p> <p>DNA was extracted from neuroblastomas of 55 Polish and 114 Italian patients and from peripheral blood leukocytes of 158 healthy controls. Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) and Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) analysis were used to screen for sequence variants. Genetic changes were confirmed by direct sequencing and correlated with biological and clinical data.</p> <p>Results</p> <p>Three previously reported and nine new single nucleotide polymorphisms were detected. c.1810C>T polymorphism present in 8.7% of cases was found to be an independent marker of disease recurrence (OR = 13.3; p = 0.009) associated with lower survival rates (HR = 4.45 p = 0.041). c.1810C>T polymorphism's unfavourable prognostic value was most significant in patients under 18 months of age with no <it>MYCN </it>amplification (HR = 26; p = 0.008). <it>In-silico </it>analysis of the c.1810C>T polymorphism suggests that the substitution of the corresponding amino acid residue within the conservative region of the tyrosine kinase domain might theoretically interfere with the functioning of the TrkA protein.</p> <p>Conclusions</p> <p><it>NTRK1 </it>c.1810C>T polymorphism appears to be a new independent prognostic factor of poor outcome in neuroblastoma, especially in children under 18 months of age with no <it>MYCN </it>amplification.</p

Skuteczna chemioterapia indukująco-konsolidująca u 20-letniej chorej na ostrą białaczkę promielocytową niewyrażającej zgody na przetoczenia preparatów krwiopochodnych z powodu przekonań religijnych

This paper describes a case of 20 years old woman with acute promyelocytic leukemia who refused to accept blood transfusion because of religious beliefs. Individualized induction chemotherapy with daunorubicin, cladribine, cytarabine and all-trans retinoic acid was administered and complete remission was achieved. Grade 4 leukopenia, anemia and thrombocytopenia was observed during induction chemotherapy. Then three consecutive consolidation cycles were given without important complications. In control molecular analysis after induction-consolidation therapy there was no PML-RARA fusion gene detected.W pracy opisano przypadek 20-letniej chorej na ostrą białaczkę promielocytową, która z powodu przekonań religijnych nie wyrażała zgody na przetaczanie preparatów krwiopochodnych. U pacjentki zastosowano zindywidualizowane leczenie indukujące daunorubicyną, cytarabiną, kladrybiną i kwasem all-trans retinowym, uzyskując całkowitą remisję (CR). W trakcie chemioterapii indukującej obserwowano jedynie toksyczność hematologiczną pod postacią leukopenii, niedokrwistości i małopłytkowości 4. stopnia. Po uzyskaniu CR chora otrzymała kolejno trzy kursy chemioterapii konsolidującej bez istotnych powikłań. W kontrolnym badaniu molekularnym po zakończeniu chemioterapii indukująco-konsolidującej nie stwierdzono obecności genu fuzyjnego PML-RARA

Soft tissue sarcoma - diagnosis and treatment

W ciągu ostatnich kilkunastu lat osiągnięto znaczący postęp w leczeniu mięsaków tkanek miękkich - nie tylko ogniska pierwotnego, ale również wznów miejscowych i przerzutów. Podstawową metodą jest leczenie chirurgiczne, a wprowadzenie zasady skojarzonego postępowania, czyli standardowego łączenia chirurgii z radioterapią i niekiedy chemioterapią oraz rehabilitacji w wyspecjalizowanych ośrodkach znamiennie zwiększyło szansę na ograniczenie zasięgu operacji, całkowite wyleczenie chorego lub uzyskanie długoletniego przeżycia. Współczesne leczenie skojarzone oraz stosowanie metod rekonstrukcyjnych pozwala u większości chorych na mięsaki tkanek miękkich o lokalizacji kończynowych na oszczędzenie kończyny. W porównaniu z latami 60.-70., kiedy amputację wykonywano u około 50% chorych, obecnie w ośrodkach referencyjnych odsetek ten nie przekracza 10%. Ogólnie obserwuje się powolny, ale stały wzrost odsetka chorych na mięsaki tkanek miękkich z wieloletnimi przeżyciami. Wskaźnik 5-letnich przeżyć całkowitych chorych na mięsaki tkanek miękkich zlokalizowane w obrębie kończyn wynosi obecnie 55-78%. W przypadku rozpoznania przerzutów długość okresu przeżycia jest jednak nadal zła i wynosi średnio około 1 roku. Korzystnych wyników miejscowych leczenia mięsaków można spodziewać się tylko w przypadku planowego (tzn. po wcześniejszej biopsji) całkowitego wycięcia mięsaka w mikroskopowo wolnych od nowotworu granicach (tzw. resekcja R0). Po przeprowadzeniu prawidłowego postępowania diagnostycznego u większości chorych poddawanych radykalnej operacji konieczne jest zastosowanie uzupełniającej radioterapii, wielotygodniowej rehabilitacji i kontynuowanie badań kontrolnych w tym samym ośrodku przez minimum 5 lat. Postęp wiąże się z wprowadzeniem do praktyki klinicznej leków o celowanym działaniu związanym z molekularnymi lub genetycznymi zaburzeniami w komórkach, które uczestniczą w etiopatogenezie tych nowotworów. Ze względu na rzadkie występowanie mięsaków oraz konieczność skojarzonego postępowania najważniejsze jest prowadzenie diagnostyki i terapii już od początku w ramach wielodyscyplinarnego zespołu w ośrodku onkologicznym o odpowiednim doświadczeniu i zapleczu diagnostycznym.Significant progress in the treatment of soft tissue sarcoma (STS), both primary tumor and local recurrences/ metastatic disease, has been achieved in recent years. Surgery is essential modality, but the use of combined treatment (standard combination of surgery with adjuvant radiotherapy, chemotherapy in selected cases and perioperative rehabilitation) in highly-experienced centers increased possibility of cure and limitations of extent of local surgery. Current combined therapy together with the use of reconstructive methods allows for limb-sparing surgery in majority of soft tissue sarcoma patients (amputation in 10% of cases as compared to approximately 50% in the 1960-70s). The slow, but constant, increase of rate of soft tissue sarcoma patients with long-term survival has been observed. Contemporary 5-year overall survival rate in patients with extremity soft tissue sarcomas is 55-78%. In case of diagnosis of metastatic disease the prognosis is still poor (survival of approximately 1 year). Good results of local therapy may be expected only after planned (e.g., after preoperative biopsy - tru-cut or incisional) radical surgical excision of primary tumor with pathologically negative margins (R0 resection). Following appropriate diagnostic check-up, adjuvant radiotherapy is necessary in the majority of patients treated with radical surgery need, as well as long-term rehabilitation and follow-up examinations in treating center are needed for at least 5 years. The progress is due to the introductionof targeted therapy acting on molecular or genetic cellular disturbances detected during studies on etiopathogenetic mechanisms of sarcoma subtypes. In view of rarity of sarcomas and necessity of multidisciplinary therapy, the crucial issue is that management of these tumors should be hold in experienced oncological sarcoma centers

Cornelia de Lange syndrome with NIBPL mutation and mosaic Turner syndrome in the same individual

Background: Cornelia de Lange syndrome (CdLS) is a dominantly inherited disorder characterized by facial dysmorphism, growth and cognitive impairment, limb malformations and multiple organ involvement. Mutations in NIPBL gene account for about 60% of patients with CdLS. This gene encodes a key regulator of the Cohesin complex, which controls sister chromatid segregation during both mitosis and meiosis. Turner syndrome (TS) results from the partial or complete absence of one of the X chromosomes, usually associated with congenital lymphedema, short stature, and gonadal dysgenesis. Case presentation: Here we report a four-year-old female with CdLS due to a frameshift mutation in the NIPBL gene (c.1445_1448delGAGA), who also had a tissue-specific mosaic 45,X/46,XX karyotype. The patient showed a severe form of CdLS with craniofacial dysmorphism, pre- and post-natal growth delay, cardiovascular abnormalities, hirsutism and severe psychomotor retardation with behavioural problems. She also presented with minor clinical features consistent with TS, including peripheral lymphedema and webbed neck. The NIPBL mutation was present in the two tissues analysed from different embryonic origins (peripheral blood lymphocytes and oral mucosa epithelial cells). However, the percentage of cells with monosomy X was low and variable in tissues. These findings indicate that, ontogenically, the NIPBL mutation may have appeared before the mosaic monosomy X. Conclusions: The coexistence in several patients of these two rare disorders raises the issue of whether there is indeed a cause-effect association. The detailed clinical descriptions indicate predominant CdLS phenotype, although additional TS manifestations may appear in adolescence

Mutational analysis of BRCA1/2 in a group of 134 consecutive ovarian cancer patients. Novel and recurrent BRCA1/2 alterations detected by next generation sequencing

The importance of proper mutational analysis of BRCA1/2 in individuals at risk for hereditary breast and ovarian cancer syndrome is widely accepted. Standard genetic screening includes targeted analysis of recurrent, population-specific mutations. The purpose of the study was to establish the frequency of germline BRCA1/2 mutations in a group of 134 unrelated patients with primary ovarian cancer. Next generation sequencing analysis revealed a presence of 20 (14.9 %) mutations, where 65 % (n = 13) were recurrent BRCA1 alterations included in the standard diagnostic panel in northern Poland. However, the remaining seven BRCA1/2 mutations (35 %) would be missed by the standard approach and were detected in unique patients. A substantial proportion (n = 5/12; 41 %) of mutation-positive individuals with complete family history reported no incidence of breast or ovarian cancer in their relatives. This observation, together with the raising perspectives for personalized therapy targeting BRCA1/2 signaling pathways indicates the necessity of comprehensive genetic screening in all ovarian cancer patients. However, due to the limited sensitivity of the standard genetic screening presented in this study (65 %) an application of next generation sequencing in molecular diagnostics of BRCA1/2 genes should be considered

Dorosły z rzadkim schorzeniem genetycznym - diagnostyka i terapia zespołu Cornelii de Lange

Zespół Cornelii de Lange (CdLS, OMIM 122470) jest rzadkim genetycznie uwarunkowanym schorzeniem. Do podstawowych cech klinicznych tego zespołu należą: charakterystyczna dysmorfia twarzy, pre- i postnatalne zaburzenie wzrostu, opóźnienie rozwoju psychomotorycznego znacznego stopnia, wady rozwojowe kończyn, serca, narządu wzroku, układu moczowo-płciowego oraz zaburzenia żołądkowo-jelitowe. Charakterystyczny fenotyp obecny w dzieciństwie zmienia się z wiekiem, co utrudnia rozpoznanie tego zespołu u osób dorosłych, zwłaszcza w przypadku braku wad rozwojowych kończyn. U większości chorych stwierdza się także zaburzenia funkcji przewodu pokarmowego - przede wszystkim refluks żołądkowo-przełykowy. Część chorych wymaga chirurgicznych zabiegów antyrefluksowych mimo stosowanego od wczesnego dzieciństwa leczenia zachowawczego. Poza tym większość chorych wykazuje umiarkowany lub głęboki stopień upośledzenia umysłowego, a objawy nadpobudliwości, autoagresji, zachowania autystyczne nasilają się z wiekiem. Obserwowany brak lub ubogi zakres mowy nie zawsze mają związek z niedosłuchem. Obserwuje się wyraźnie przedwczesne starzenie się osób z CdLS. W Gdańskim Uniwersytecie Medycznym działa system wielospecjalistycznej opieki nad pacjentami z CdLS. Wielonarządowy charakter zaburzeń nakazuje bowiem objęcie dorosłych z CdLS wielospecjalistyczną opieką, co pozwoli nie tylko przedłużyć życie pacjentów, ale zapewnić im większy jego komfort. Forum Medycyny Rodzinnej 2010, tom 4, nr 4, 273-28

Validation of selected medical centers involved in molecular diagnostics of cancer in the field of EGFR1 mutations determination

Rak płuca to jeden najczęściej występujących nowotworów złośliwych w Polsce i na świecie. Według danych statystycznych rocznie jest przyczyną zgonów 1,3 miliona osób na całym świecie. W niedrobnokomórkowym raku płuc (NDRP) u niektórych chorych (10&#8211;15% Ameryka Północna i Europa Zachodnia; 30&#8211;35% Japonia i Wschodnia część Azji) występują mutacje somatyczne w genie receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) powodujące stałą aktywność tego receptora. Występowanie takich mutacji ściśle wiąże się ze skutecznością działania niektórych inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI). Określenie statusu genu EGFR jest kluczowe w doborze najbardziej odpowiedniego schematu leczenia chorych z NDRP. Celem tej pracy jest wykazanie, czy ośrodki zaangażowane w diagnostykę molekularną chorób nowotworowych posiadają odpowiedni potencjał, aby skutecznie przeprowadzić analizę statusu genu EGFR1 w zakresie zmian w eksonach 19. i 21. Dodatkowym celem jest wypracowanie odpowiednich standardów postępowania. Wynikiem przeprowadzonego procesu walidacji są następujące zalecenia dla laboratoriów diagnostycznych: 1. Materiał do izolacji DNA powinien zawierać nie mniej niż 50% utkania nowotworowego; 2. Ujednolicenie procedury izolacji DNA ze skrawków parafinowych wymaga stosowania gotowego zestawu do izolacji DNA; 3. W przypadku braku jednoznacznego wyniku, powinno się wykorzystać dwie metody oznaczania mutacji, zaleca się, aby jednego z wykonywanych oznaczeń dokonać przy wykorzystaniu metody sekwencjonowania bezpośredniego; 4. Zaleca się rozszerzenie panelu analizowanych eksonów do 18., 19., 20. i 21.; 5. Od momentu wypisania skierowania na badanie diagnostyczne do momentu przekazania wyniku badania nie powinno upłynąć więcej niż 10 dni roboczych. Onkol. Prak. Klin. 2011; 7, 3: 138&#8211;145Lung cancer is one of the most common cancers in Poland and abroad. According to statistics, it causes the death of 1.3 million people per year worldwide. In a nonsmall cell lung cancer (NSCLC), some patients have somatic mutations in the gene for epidermal growth factor receptor (EGFR), resulting in a constant activity of this receptor (10&#8211;15% patients of North American and Western European origin, and 30&#8211;35% of patients from Japan and Eastern Asia). The occurrence of such mutations is closely associated with efficacy of tyrosine kinase inhibitors (TKI). Thus, determination of EGFR status is crucial in selecting the most appropriate treatment of patients with NSCLC. The aim of this paper is to show whether the laboratories involved in molecular diagnostics for cancer have the potential to effectively determinate the mutation status (in exons 19 and 21) of the EGFR1 gene. An additional objective is to develop appropriate standards for mutation testing in non-small cell lung cancer. As the result of valiadtion process conducted in the study, the following recommendations for diagnostic laboratories were approved: at least 50% of cancer cells should be present in a tissue for DNA isolation; 2. The method of DNA isolation should be standardized, the most appropriate is usage of DNA isolation kits; 3. In case of equivocal results two independent molecular methods should be employed, one of them should be direct sequencing; 4. It is recommended to extend the panel of analyzed exons to 18, 19, 20 and 21; 5 The turnaround time (TAT) should not take more than 10 working days Onkol. Prak. Klin. 2011; 7, 3: 138&#8211;14