Capsids, Matrices and Vesicles : Structural Insights into the Assembly of Paramyxoviruses

Paramyxoviridae constitute a family of pleomorphic, enveloped viruses including several human pathogens. Understanding of the structure and assembly of paramyxoviruses has been hindered by the lack of whole-virion three-dimensional structures. In this work, measles and human respiratory syncytial viruses were studied with three-dimensional electron microscopy and biochemical analysis of recombinant proteins. The analysis revealed significant differences in the structure and assembly of the two viruses. The differences were most notable in the way the matrix protein, the main factor driving budding from host cell, was organized inside the virions. In measles virions, the matrix was found to cover the genome-containing ribonucleocapsid, whereas in human respiratory syncytial virus the matrix was lining the inner surface of the membrane vesicle. These differences have implications on models of how each ribonucleoprotein complex assembles and how the viruses bud from the host cell. The early control of measles ribonucleoprotein assembly was subsequently investigated to further reveal the details of the precise manner in which the intricate molecular ballet of viral assembly is orchestrated inside the host cell. The results presented in this thesis expand the understanding of enveloped virus structure and assembly, which is important in rational approaches to fight the pathogenic members in the group.Missä on elämää, siellä on myös viruksia. Viruksia on arvioitu olevan yhteensä yli kymmenkertainen määrä kaikkien muiden maapallon eliöiden yhteenlaskettuun määrään verrattuna. Valtaosa viruksista ei tartu ihmisiin, mutta osa ihmisten viruksista, kuten esimerkiksi HIV ja influenssavirukset, aiheuttavat vakavia sairauksia. Virukset tarvitsevat isäntäsolun lisääntyäkseen ja ne ovatkin kehittyneet hyödyntämään monia isäntäsolujen toimintoja. Monet ihmisviruksista ovat vaipallisia viruksia, joiden perimäaines siirtyy ihmisestä toiseen isäntäsolusta kaapatun rasvahappovaipan sisällä. Viruksen perimäaineksen sisältävä vaippa kuroutuu yleensä solun ulkopinnalta viruksen ns. matriisiproteiinien avulla. Yksittäisten matriisiproteiinien tiedetään kykenevän järjestäytymään lakanamaisiksi kerroksiksi tai jousimaisiksi kierrerakenteiksi, mutta niiden järjestäytymistapa kuroutumisen aikana ja kuroutuneen viruspartikkelin sisällä ei useimmissa tapauksissa ole tiedossa. Yleisesti uskotaan kuitenkin, että matriisiproteiinit muodostavat yhtenäisen kerroksen solun rasvahappokalvon sisäpuolelle kuroutumisen aikana ja saavat aikaan rasvahappokerroksen pyöristymisen sekä lopulta viruspartikkelin irtoamisen solusta. Tässä tutkimuksessa selvitettiin kahden tautia aiheuttavan ihmisviruksen, tuhkarokko- sekä RS-viruksen, rakenteet kolmiulotteisen elektronimikroskopian avulla. Rakenteista paljastui muun muassa matriisiproteiinien järjestäytyminen viruspartikkelin sisällä. Tuhkarokkoviruksessa matriisiproteiinit olivat järjestäytyneet jousimaiseen muotoon perimäaineksen sisältävän ns. nukleokapsidin ympärille ja viruspartikkelit olivat pyöreähköjä, kun taas RS-viruksessa matriisiproteiinit muodostivat putkimaisen rakenteen rasvahappovaipan sisäpinnalle pakottaen koko viruspartikkelin putkimuotoon. Nämä havainnot, erityisesti tuhkarokkoviruksen osalta, muuttavat käsitystä matriisiproteiinien roolista kuroutumisessa. Matriisiproteiinien todettiin muodostavan kerroksen nukleokapsidin ympärille jo solun sisällä, joten vastoin aiempaa käsitystä, ne eivät muodosta yhtenäistä kerrosta rasvahappokalvon alle kuroutumisen aikana. Vastuu kuroutumisesta saattaa siis olla ainakin osittain muilla, toistaiseksi tuntemattomilla tekijöillä. Taudinaiheuttajavirusten elämänvaiheiden yksityiskohtainen molekyylitason ymmärtäminen on tärkeää, jotta voitaisiin kehittää tehokkaita täsmälääkkeitä sekä rokotteita näitä viruksia vastaan

Structural insights into phosphoprotein chaperoning of nucleoprotein in measles virus

Instruct Biennial Structural Biology Conference Abstract BookletMeasles virus is an important, highly contagious, human pathogen. The nucleoprotein N binds only to viral genomic RNA and forms the helical ribonucleocapsid that serves as a template for viral replication. We address how N is regulated by another protein, the phosphoprotein, P, to prevent newly synthesized N from binding to cellular RNA. Here, we pulled down an N01-408 fragment lacking most of its C-terminal tail domain by several affinity-tagged, N-terminal, P fragments to map the N0-binding region of P to the first 48 amino acids. We showed biochemically and using P mutants the importance of the hydrophobic interactions for the binding. We fused an N0 binding peptide, P1-48, to the C-terminus of an N021-408 fragment lacking both the N-terminal peptide and the C-terminal tail of N protein to reconstitute and crystallize the N0-P complex. We solved the X-ray structure of the resulting N0-P chimeric protein at 2.7 Å resolution. The structure reveals the molecular details of the conserved N0-P interface and explains how P chaperones N0 preventing both self-assembly of N0 and its binding to RNA. We compare the structure of an N0-P complex to atomic model of helical ribonucleocapsid. We thus propose a model how P may help to start viral RNA synthesis. Our results provide a new insight into mechanisms of paramyxovirus replication. New data on the mechanisms of phosphoprotein chaperone action allows better understanding of the virus genome replication and nucleocapsid assembly. We describe a conserved structural interface for the N-P interaction which could be a target for drug development not only to treat measles but also potentially other paramyxovirus diseases.Non peer reviewe

Crystal Structure of the Measles Virus Nucleoprotein Core in Complex with an N-terminal Region of Phosphoprotein

ABSTRACT The enveloped negative-stranded RNA virus measles virus (MeV) is an important human pathogen. The nucleoprotein (N0) assembles with the viral RNA into helical ribonucleocapsids (NC) which are, in turn, coated by a helical layer of the matrix protein. The viral polymerase complex uses the NC as its template. The N0 assembly onto the NC and the activity of the polymerase are regulated by the viral phosphoprotein (P). In this study, we pulled down an N0 1-408 fragment lacking most of its C-terminal tail domain by several affinity-tagged, N-terminal P fragments to map the N0-binding region of P to the first 48 amino acids. We showed biochemically and using P mutants the importance of the hydrophobic interactions for the binding. We fused an N0 binding peptide, P1-48, to the C terminus of an N0 21-408 fragment lacking both the N-terminal peptide and the C-terminal tail of N protein to reconstitute and crystallize the N0-P complex. We solved the X-ray structure of the resulting N0-P chimeric protein at a resolution of 2.7 Å. The structure reveals the molecular details of the conserved N0-P interface and explains how P chaperones N0, preventing both self-assembly of N0 and its binding to RNA. Finally, we propose a model for a preinitiation complex for RNA polymerization. IMPORTANCE Measles virus is an important, highly contagious human pathogen. The nucleoprotein (N) binds only to viral genomic RNA and forms the helical ribonucleocapsid that serves as a template for viral replication. We address how N is regulated by another protein, the phosphoprotein (P), to prevent newly synthesized N from binding to cellular RNA. We describe the atomic model of an N-P complex and compare it to helical ribonucleocapsid. We thus provide insight into how P chaperones N and helps to start viral RNA synthesis. Our results provide a new insight into mechanisms of paramyxovirus replication. New data on the mechanisms of phosphoprotein chaperone action allows better understanding of virus genome replication and nucleocapsid assembly. We describe a conserved structural interface for the N-P interaction which could be a target for drug development to treat not only measles but also potentially other paramyxovirus diseases.Peer reviewe

In vivo gene expression profiling of Staphylococcus aureus during infection informs design of stemless leukocidins LukE and -D as detoxified vaccine candidates

A.F.H. and L.L. were funded by Marie Sklodowska-Curie Intra-European Fellowships (PIEF-GA-2012-328377 and PIEF-GA-2013-623168, respectively).Staphylococcus aureus is a clinically important bacterial pathogen that has become resistant to treatment with most routinely used antibiotics. Alternative strategies, such as vaccination and phage therapy, are therefore actively being investigated to prevent or combat staphylococcal infections. Vaccination requires that vaccine targets are expressed at sufficient quantities during infection so that they can be targeted by the host’s immune system. While our knowledge of in vitro expression levels of putative vaccine candidates is comprehensive, crucial in vivo expression data are scarce and promising vaccine candidates during in vitro assessment often prove ineffective in preventing S. aureus infection. Here, we show how a newly developed high-throughput quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) assay monitoring the expression of 84 staphylococcal genes encoding mostly virulence factors can inform the selection and design of effective vaccine candidates against staphylococcal infections. We show that this assay can accurately quantify mRNA expression levels of these genes in several host organs relying only on very limited amounts of bacterial mRNA in each sample. We selected two highly expressed genes, lukE and lukD, encoding pore-forming leukotoxins, to inform the design of detoxified recombinant proteins and showed that immunization with recombinant genetically detoxified LukED antigens conferred protection against staphylococcal skin infection in mice. Consequently, knowledge of in vivo-expressed virulence determinants can be successfully deployed to identify and select promising candidates for optimized design of effective vaccine antigens against S. aureus. Notably, this approach should be broadly applicable to numerous other pathogens.Publisher PDFPeer reviewe

Comprehensive genomic profiling of Finnish lung adenocarcinoma cohort reveals high clinical actionability and SMARCA4 altered tumors with variable histology and poor prognosis

Introduction: Lung adenocarcinoma is the most common type of lung cancer and typically carries a high number of mutations. However, the genetic background of the tumors varies according to patients' ethnic background and smoking status. Little data is available on the mutational landscape and the frequency of actionable genomic alterations in lung adenocarcinoma in the Finnish population. Materials and methods: We evaluated the gene alteration frequencies of 135 stage I-IV lung adenocarcinomas operated at Turku University Hospital between 2004 and 2017 with a large commercial comprehensive genomic profiling panel. Additionally, we correlated the alterations in selected genes with disease outcomes in 115 stage I-III patients with comprehensive follow-up data. The genomic alterations in a sub-cohort of 30 never-smokers were assessed separately. Results: Seventy percent of patients in the overall cohort and 77% in the never-smoker sub-cohort harbored an alteration or a genomic signature targetable by FDA and/or EMA approved drug for non-small cell carcinoma, respectively. In multivariable analysis for disease-specific survival, any alteration in SMARCA4 (DSS; HR 3.911, 95%CI 1.561-9.795, P = 0.004) exhibited independent prognostic significance along with stage, tumor mutation burden, and predominant histological subtypes. Conclusions: Over two thirds of our overall cohort, and especially never-smokers had an actionable genomic alteration or signature. SMARCA4 alterations, detected in 7.4% of the tumors, independently predicted a shortened overall and disease-specific survival regardless of the alteration type. Most SMARCA4 alterations in our cohort were missense mutations associated with differentiated predominant histological subtypes and immunohistochemical SMARCA4/BRG1 and TTF-1 positive status.</p

High tumor mutation burden predicts favorable outcome among patients with aggressive histological subtypes of lung adenocarcinoma : A population-based single-institution study

Objectives: Tumor mutation burden (TMB) is an emerging predictive cancer biomarker. Few studies have addressed the prognostic role of TMB in non-small cell lung carcinoma, with conflicting results. Moreover, the association of TMB with different histological subtypes of lung adenocarcinoma has hitherto not been systematically evaluated. Here we studied the prognostic value of TMB and its distribution in different histological subtypes of lung adenocarcinomas in a retrospective cohort using the most recent updated classification guidelines. Materials and methods: 176 surgically resected stage I-IV lung adenocarcinomas were histologically reclassified according to WHO 2015 guidelines. A modified classification subdividing the acinar subtype into classic acinar, complex glandular and cribriform subtypes was further applied and potentially prognostic histopathological characteristics such as tumor-infiltrating lymphocytes were evaluated. 148 patients with stage I-III tumors and complete follow-up data were included in the survival analyses. TMB was determined by a commercial next generation sequencing panel from 131 tumors, out of which 105 had survival data available. Results: Predominant micropapillary, solid and complex glandular as well as nonpredominant cribriform histological subtypes were associated with significantly shorter survival. High TMB concentrated in micropapillary, solid and acinar predominant subtypes. Interestingly, TMB >= 14 mutations/MB conferred a stage- and histology-independent survival benefit compared to TMB <14 in multivariable analysis for overall (HR 0.284, 95% CI 0.14-0.59, P=0.001) and disease-specific survival (HR 0.213, 95% CI 0.08-0.56, P=0.002). Conclusion: TMB was an independent biomarker of favorable prognosis in our cohort of lung adenocarcinoma despite being associated with predominant histological subtypes considered aggressive.Peer reviewe

Clostridium butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin kloonaus ja säätelyn toiminta Escherichia coli:ssa ja Bacillus subtilis:ssa

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet Vetyä pidetään ympäristöystävällisyytensä vuoksi yhtenä tulevaisuuden polttoaineista. Sen ympäristöystävällisyys riippuu kuitenkin tuotantotavoista, jotka nykyisellään eivät ole ekologisesti kestäviä. Biologinen vedyntuotto tarjoaa mahdollisuuden tuottaa vetyä uusiutuvista energianlähteistä kuten auringonvalosta ja biojätteestä. Biologinen vedyntuotto ei kuitenkaan toistaiseksi ole taloudellisesti kannattavaa, joten tuottoa pyritään parantamaan geneettisellä muokkauksella. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kloonata pimeäfermentatiivisen vedyntuottajan Clostridium butyricum:n vedyntuottoon liittyvän 1,3-propaanidiolioperonin promoottori säätelytekijöineen ja tutkia sen toimintaa E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa. Tutkimusmenetelmät Kloonauksissa käytettiin molekyylibiologian yleisiä työmenetelmiä. Promoottorin säätelyä tutkittiin lusiferaasireportterin avulla. Kokeet toteutettiin lisäämällä solukasvatuksiin oletettuja indusoreita glyserolia sekä 1,3-propaanidiolia ja seuraamalla tuotetun lusiferaasin määrää luminesenssimittauksin. Tutkimustulokset Promoottori säätelytekijöineen saatiin kloonattua ja E. coli sekä B. subtilis transformoitua rakennetulla vektorilla. Promoottori osoittautui molemmissa lajeissa aktiiviseksi, mutta glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla ei havaittu olevan merkittävää vaikutusta sen aktiivisuuteen. Tulosten tarkastelu Aiempien tutkimusten perusteella oletettiin, että 1,3-propaanidiolioperonin transkriptio on ylävirran kahden komponentin signaalinvälitysjärjestelmän säätelyn alaista. Hypoteesina oli, että transkriptio indusoituu glyserolin tai 1,3-propaanidiolin sitoutuessa sensoriproteiiniin. E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa näin ei kuitenkaan todettu tapahtuvan. Tämä saattaa johtua signaalinvälitysjärjestelmän virheellisestä toiminnasta näissä lajeissa. On myös mahdollista, että sensori tunnistaa jonkin muun C. butyricum:n glyseroliaineenvaihdunnalle ominaisen tekijän kuin itse glyserolin tai 1,3-propaanidiolin, ja saadut tulokset johtuvat kyseisen tekijän puuttumisesta tutkituissa lajeissa. Johtopäätökset C. butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin ei todettu aktivoituvan glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla E. coli:ssa tai B. subtilis:ssa. Luotettavamman tiedon promoottorin säätelystä saamiseksi olisi pyrittävä tutkimaan sen toimintaa jossakin C. butyricum:n lähisukulaislajissa kuten C. acetobutylicum:ssa. Asiasanat: 1,3-propaanidioli, biodiesel, biologinen vedyntuotto, Clostridium butyricum, lusiferaas

Clostridium butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin kloonaus ja säätelyn toiminta Escherichia coli:ssa ja Bacillus subtilis:ssa

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet Vetyä pidetään ympäristöystävällisyytensä vuoksi yhtenä tulevaisuuden polttoaineista. Sen ympäristöystävällisyys riippuu kuitenkin tuotantotavoista, jotka nykyisellään eivät ole ekologisesti kestäviä. Biologinen vedyntuotto tarjoaa mahdollisuuden tuottaa vetyä uusiutuvista energianlähteistä kuten auringonvalosta ja biojätteestä. Biologinen vedyntuotto ei kuitenkaan toistaiseksi ole taloudellisesti kannattavaa, joten tuottoa pyritään parantamaan geneettisellä muokkauksella. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kloonata pimeäfermentatiivisen vedyntuottajan Clostridium butyricum:n vedyntuottoon liittyvän 1,3-propaanidiolioperonin promoottori säätelytekijöineen ja tutkia sen toimintaa E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa. Tutkimusmenetelmät Kloonauksissa käytettiin molekyylibiologian yleisiä työmenetelmiä. Promoottorin säätelyä tutkittiin lusiferaasireportterin avulla. Kokeet toteutettiin lisäämällä solukasvatuksiin oletettuja indusoreita glyserolia sekä 1,3-propaanidiolia ja seuraamalla tuotetun lusiferaasin määrää luminesenssimittauksin. Tutkimustulokset Promoottori säätelytekijöineen saatiin kloonattua ja E. coli sekä B. subtilis transformoitua rakennetulla vektorilla. Promoottori osoittautui molemmissa lajeissa aktiiviseksi, mutta glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla ei havaittu olevan merkittävää vaikutusta sen aktiivisuuteen. Tulosten tarkastelu Aiempien tutkimusten perusteella oletettiin, että 1,3-propaanidiolioperonin transkriptio on ylävirran kahden komponentin signaalinvälitysjärjestelmän säätelyn alaista. Hypoteesina oli, että transkriptio indusoituu glyserolin tai 1,3-propaanidiolin sitoutuessa sensoriproteiiniin. E. coli:ssa ja B. subtilis:ssa näin ei kuitenkaan todettu tapahtuvan. Tämä saattaa johtua signaalinvälitysjärjestelmän virheellisestä toiminnasta näissä lajeissa. On myös mahdollista, että sensori tunnistaa jonkin muun C. butyricum:n glyseroliaineenvaihdunnalle ominaisen tekijän kuin itse glyserolin tai 1,3-propaanidiolin, ja saadut tulokset johtuvat kyseisen tekijän puuttumisesta tutkituissa lajeissa. Johtopäätökset C. butyricum:n 1,3-propaanidiolioperonin promoottorin ei todettu aktivoituvan glyserolilla tai 1,3-propaanidiolilla E. coli:ssa tai B. subtilis:ssa. Luotettavamman tiedon promoottorin säätelystä saamiseksi olisi pyrittävä tutkimaan sen toimintaa jossakin C. butyricum:n lähisukulaislajissa kuten C. acetobutylicum:ssa. Asiasanat: 1,3-propaanidioli, biodiesel, biologinen vedyntuotto, Clostridium butyricum, lusiferaas