Evidence for a Dinuclear Active Site in the Metallo-β-lactamase BcII with Substoichiometric Co(II): A New Model for Uptake

Metallo-β-lactamases are zinc-dependent enzymes that constitute one of the main resistance mechanisms to β-lactam antibiotics. Metallo-β-lactamases have been characterized both in mono- and dimetallic forms. Despite many studies, the role of each metal binding site in substrate binding and catalysis is still unclear. This is mostly due to the difficulties in assessing the metal content and site occupancy in solution. For this reason, Co(II) has been utilized as a useful probe of the active site structure. We have employed UV-visible, EPR, and NMR spectroscopy to study Co(II) binding to the metallo-β-lactamase BcII from Bacillus cereus. The spectroscopic features were attributed to the two canonical metal binding sites, the 3H (His116, His118, and His196) and DCH (Asp120, Cys221, and His263) sites. These data clearly reveal the coexistence of mononuclear and dinuclear Co(II)-loaded forms at Co(II)/enzyme ratios as low as 0.6. This picture is consistent with the macroscopic dissociation constants here determined from competition binding experiments. A spectral feature previously assigned to the DCH site in the dinuclear species corresponds to a third, weakly bound Co(II) site. The present work emphasizes the importance of using different spectroscopic techniques to follow the metal content and localization during metallo-β-lactamase turnover

Relación entre los cambios en la elongación axial y el poder del cristalino en niños pequeños con y sin lentes de contacto de control de miopía

OBJETIVO: El principal objetivo de este producidos en el cristalino en el control de la miopía con el crecimiento del ojo y el uso de lentes de contacto que limitan el desarrollo de la miopía en niños, utilizando refracciones ciclopléjicas y biometrías oculares. Haremos un cálculo con la fórmula de Bennet para derivar con precisión la potencia del cristalino para cada individuo y, estudiaremos el cambio entre grupos de la potencia del cristalino y miopes que están siendo tratados con un nuevo modelo de lente de gradiente periférico (AMIOPIK). MATERIAL Y MÉTODOS: Se recogieron los datos refractivos y biométricos de 27 ojos del grupo experimental y 25 ojos del grupo control de un estudio previo y, se realizó un cálculo con la fórmula de Bennet para derivar con precisión la potencia del cristalino para cada individuo. diferencias entre los grupos realizando RESULTADOS: No hemos encontrado diferencias significativas en ningún caso pero, la longitud de la cámara vítrea y la longitud axial han dado parámetros cercanos al nivel de significancia. Además, la potencia de la lente parece disminuir en el primer año en el grupo ex CONCLUSIONES: Nosotros no hemos encontrado diferencias significativas en ningún caso pero, la longitud de la cámara vítrea y la longitud axial han dado parámetros c Teniendo en cuenta que en la tesis del Dr. significativas en la longitud axial y que la potencia de la lente parece disminuir en el primer año en el grupo experimental, podemos intuir que el cristalino puede desarrollar un papel importante en el proceso de con MÁSTER UNIVERSITARIO EN OPTOMETRÍA Y CIENCIAS DE LA VISIÓN ISEÑO DE UN ESTUDIO RETROSPECTIVO PARA VALIDAR EL CRECIMIENTO DEL OJO CON EL USO DE LENTES DE CONTACTO QUE LIMITAN EL DESARROLLO DE MIOPÍA El principal objetivo de este trabajo es estudiar la función que desempeñan los cambios producidos en el cristalino en el control de la miopía. Para ello correlaciona con el crecimiento del ojo y el uso de lentes de contacto que limitan el desarrollo de la miopía s, utilizando refracciones ciclopléjicas y biometrías oculares. Haremos un cálculo con la fórmula de Bennet para derivar con precisión la potencia del cristalino para cada individuo y, estudiaremos el cambio entre grupos de la potencia del cristalino y la miopes que están siendo tratados con un nuevo modelo de lente de gradiente periférico MATERIAL Y MÉTODOS: e recogieron los datos refractivos y biométricos de 27 ojos del grupo experimental y 25 ojos del grupo control de un estudio previo y, se realizó un cálculo con la fórmula de Bennet para derivar con precisión la potencia del cristalino para cada individuo. diferencias entre los grupos realizando el estudio estadístico con el programa Minitab v18. No hemos encontrado diferencias significativas en ningún caso pero, la longitud de la cámara vítrea y la longitud axial han dado parámetros cercanos al nivel de significancia. Además, la potencia de la lente parece disminuir en el primer año en el grupo experimental. no hemos encontrado diferencias significativas en ningún caso pero, la longitud de la cámara vítrea y la longitud axial han dado parámetros cercanos a la significatividad. eniendo en cuenta que en la tesis del Dr. Jaumé Pauné Fabré existían diferencias significativas en la longitud axial y que la potencia de la lente parece disminuir en el primer año en el grupo experimental, podemos intuir que el cristalino puede desarrollar un papel importante en el proceso de control de la miopía

Asp-120 Locates Zn2 for Optimal Metallo-β-lactamase Activity

Metallo-β-lactamases are zinc-dependent hydrolases that inactivate β-lactam antibiotics, rendering bacteria resistant to them. Asp-120 is fully conserved in all metallo-β-lactamases and is central to catalysis. Several roles have been proposed for Asp-120, but so far there is no agreed consensus. We generated four site-specifically substituted variants of the enzyme BcII from Bacillus cereus as follows: D120N, D120E, D120Q, and D120S. Replacement of Asp-120 by other residues with very different metal ligating capabilities severely impairs the lactamase activity without abolishing metal binding to the mutated site. A kinetic study of these mutants indicates that Asp-120 is not the proton donor, nor does it play an essential role in nucleophilic activation. Spectroscopic and crystallographic analysis of D120S BcII, the least active mutant bearing the weakest metal ligand in the series, reveals that this enzyme is able to accommodate a dinuclear center and that perturbations in the active site are limited to the Zn2 site. It is proposed that the role of Asp-120 is to act as a strong Zn2 ligand, locating this ion optimally for substrate binding, stabilization of the development of a partial negative charge in the β-lactam nitrogen, and protonation of this atom by a zinc-bound water molecule

Evolution of Metallo-β-lactamases: Trends Revealed by Natural Diversity and in vitro Evolution

The production of β-lactamase enzymes is one of the most distributed resistance mechanisms towards β-lactam antibiotics. Metallo-β-lactamases constitute a worrisome group of these kinds of enzymes, since they present a broad spectrum profile, being able to hydrolyze not only penicillins, but also the latest generation of cephalosporins and carbapenems, which constitute at present the last resource antibiotics. The VIM, IMP, and NDM enzymes comprise the main groups of clinically relevant metallo-β-lactamases. Here we present an update of the features of the natural variants that have emerged and of the ones that have been engineered in the laboratory, in an effort to find sequence and structural determinants of substrate preferences. This knowledge is of upmost importance in novel drug design efforts. We also discuss the advances in knowledge achieved by means of in vitro directed evolution experiments, and the potential of this approach to predict natural evolution of metallo-β-lactamases.Fil: Meini, María Rocío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Llarrull, Leticia Irene. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Vila, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Daily baked egg intake may accelerate the development of tolerance to raw egg in egg-allergic children

Short communication[Abstract] Recent studies suggest that egg-allergic children who tolerate baked egg (BE) are more likely to outgrow egg allergy than children that do not tolerate it. The question to be answered is whether regular ingestion of BE accelerates tolerance to other forms of egg (cooked and raw). Our aim was to determine if daily ingestion of BE would accelerate tolerance to raw egg in BE-tolerant patients compared to patients who tolerate BE at diagnosis but eliminated it from their diet and to patients who didn't tolerate it. We performed a retrospective analysis of all children diagnosed of IgE-mediated egg allergy at the Pediatric Allergy Unit of the Complejo Hospitalario Universitario A Coruña, from 2008 to 2014. Seventy children were included. At diagnosis, 33 patients tolerated BE and kept its daily ingestion, 16 patients tolerated BE and were recommended to avoid it, and 21 patients didn't tolerate it. Patients tolerating BE who kept daily ingestion achieved tolerance to raw egg significantly earlier (p < 0.05) than the other two groups.Conclusion: Our data suggest that daily intake of BE in BE-tolerant children accelerates tolerance to raw egg.What is Known:• It has been suggested that egg-allergic children who consume baked egg (BE) products on a regular bases are more likely to outgrow egg allergy than children that do not tolerate themWhat is New:• Patients who tolerated BE on diagnosis and followed an exclusion diet show a similar evolution than patients who initially did not tolerate BE. Daily ingestion of BE seems to accelerates tolerance to raw egg

Mild to moderate hypersensitivity reactions to beta-lactams in children: a single-centre retrospective review

[Abstract] Objective: Beta-lactam (BL) antibiotics are the most reported drugs in hypersensitivity reactions in children. More than 90% of these children tolerate the suspected drug after diagnostic work-up. Skin tests (STs) show low sensitivity. Our aim was to assess the performance of drug provocation tests (DPTs) without previous ST in mild and moderate delayed reactions and to propose a new DPT protocol. Design of the study: Charts from 213 children under 15 years of age referred for suspected BL allergy from 2011 to 1013 were reviewed. Prick, intradermal and patch tests were performed with major determinant penicilloyl-polylysine, minor determinant mixture, amoxicillin (AMX), cefuroxime, penicillin G and AMX-clavulamate. Children with negative skin tests underwent DPT. After an initial full dose of antibiotic, DPT was carried on for 3 days at home in patients reacting within the first 3 days of treatment. If the reaction took place from day 4 on of treatment, patients took the antibiotic for 5 days. Results: We included 108 girls and 105 boys. Mean age at the time of reaction was 3.66±3.06 years. 195 patients (91.5%) reacted to one BL. 154 reactions (67.2%) were non-immediate. Mild to moderate skin manifestations were most frequently reported. AMX-clavulanate was the most frequently involved (63.4%). DPT confirmed the diagnosis of drug hypersensitivity in 17 (7.3%) cases. These 17 patients had negative ST. Conclusion: In mild and moderate cases of BL hypersensitivity, diagnosis can be performed by DPT without previous ST

Trapping and Characterization of a Reaction Intermediate in Carbapenem Hydrolysis by \u3cem\u3eB. cereus\u3c/em\u3e Metallo-β-lactamase

Metallo-β-lactamases hydrolyze most β-lactam antibiotics. The lack of a successful inhibitor for them is related to the previous failure to characterize a reaction intermediate with a clinically useful substrate. Stopped-flow experiments together with rapid freeze−quench EPR and Raman spectroscopies were used to characterize the reaction of Co(II)−BcII with imipenem. These studies show that Co(II)−BcII is able to hydrolyze imipenem in both the mono- and dinuclear forms. In contrast to the situation met for penicillin, the species that accumulates during turnover is an enzyme−intermediate adduct in which the β-lactam bond has already been cleaved. This intermediate is a metal-bound anionic species with a novel resonant structure that is stabilized by the metal ion at the DCH or Zn2 site. This species has been characterized based on its spectroscopic features. This represents a novel, previously unforeseen intermediate that is related to the chemical nature of carbapenems, as confirmed by the finding of a similar intermediate for meropenem. Since carbapenems are the only substrates cleaved by B1, B2, and B3 lactamases, identification of this intermediate could be exploited as a first step toward the design of transition-state-based inhibitors for all three classes of metallo-β-lactamases

Estudio de factibilidad, para la creación de una planta procesadora de vodka, por medio de la industrialización de la papa, en el cantón Montufar provincia del Carchi

El presente estudio tiene como finalidad determinar los factores internos y externos que influyen para la creación de una planta procesadora de vodka, por medio de la industrialización de la papa; localizada en el cantón Montufar provincia del Carchi; captando la producción de papa del cantón Montufar por medio de la Asociación de Papi cultores, y procesarla, tomándolos en cuenta como parte integral del proyecto. Esta investigación ha sido estructurada con seis capítulos, cuyos resultados obtenidos resumimos a continuación: Como primer elemento o componente el desarrollo de un Diagnóstico situacional el cual se enfocó a determinar variables, indicadores para llegar a la matriz de la relación diagnostica, mediante encuestas a los posibles consumidores o mercado meta y entrevistas involucrados del Cantón, además de la observación, detectando un alto grado de interés por parte de la población para la creación de una industria de este tipo, ya que contribuirá en gran medida al desarrollo socio económico del cantón; contando los papicultores con una mejor oportunidad para la venta del tubérculo y la generación de fuentes de trabajo con la creación de la planta. El segundo elemento el marco teórico, el cual se lo realizó sobre la base del análisis y síntesis de términos técnicos utilizados para la presente investigación, además tomando en cuenta información de anteriores estudios realizados referentes al proyecto, información que se captó tanto de la bibliografía actualizada, como del internet. El tercer capítulo el estudio de mercado el cual fundamentalmente es un análisis e identificación del producto, análisis de la demanda, análisis de la oferta, la determinación de precios, así como también el análisis de la comercialización, distribución y publicidad del producto, mediante estadísticas de producción de papa e importación y exportación de vodka en el Ecuador. Como cuarto componente el diseño del Estudio técnico del proyecto teniendo en cuenta el tamaño, localización del proyecto, infraestructura física, procesos productivos, tecnología, maquinaria y equipo, inversión, talento humano, etc., mediante la ayuda de expertos en el tema de construcción de la edificación y la maquinaria a utilizar. El quinto capítulo está constituido por el Estudio Económico con el cual se determinó el Capital de Trabajo e investigación diferida, presupuestos, Balance de Situación Inicial, Estado de Pérdidas y Ganancias Proyectadas, Flujo de Caja Proyectada, Determinación del Costo de Oportunidad y Tasa de Rendimiento, Evaluación Financiera, Beneficio-Costo, Periodo de Recuperación de la Inversión y su factibilidad. Finalmente se realizó un análisis de impactos en las diferentes áreas, para lo cual utilizamos matrices por cada área en la que se determinó una serie de indicadores por cada ámbito analizado, a los cuales se asignó un nivel de impacto positivo o negativo, lógicamente con el respectivo fundamento o argumento del por qué se asignó un determinado nivel de impacto a cada indicador. Todos estos aspectos antes mencionados nos permiten determinar la factibilidad de este proyecto y las oportunidades que generaría, cabe recalcar que como en todo proyecto se genera aspectos positivos los cuales se deben fortalecer, así como aspectos negativos los cuales hay que tomar las medidas necesarias para contrarrestarlos, para lo cual emitimos nuestras conclusiones y recomendaciones al finalizar el estudio

The reaction mechanism of metallo-beta-lactamases is tuned by the conformation of an active site mobile loop

Carbapenems are "last resort" β-lactam antibiotics used to treat serious and life-threatening health care-associated infections caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Unfortunately, the worldwide spread of genes coding for carbapenemases among these bacteria is threatening these life-saving drugs. Metallo-β-lactamases (MβLs) are the largest family of carbapenemases. These are Zn(II)-dependent hydrolases that are active against almost all β-lactam antibiotics. Their catalytic mechanism and the features driving substrate specificity have been matter of intense debate. The active sites of MβLs are flanked by two loops, one of which, loop L3, was shown to adopt different conformations upon substrate or inhibitor binding, and thus are expected to play a role in substrate recognition. However, the sequence heterogeneity observed in this loop in different MβLs has limited the generalizations about its role. Here, we report the engineering of different loops within the scaffold of the clinically relevant carbapenemase NDM-1. We found that the loop sequence dictates its conformation in the unbound form of the enzyme, eliciting different degrees of active-site exposure. However, these structural changes have a minor impact on the substrate profile. Instead, we report that the loop conformation determines the protonation rate of key reaction intermediates accumulated during the hydrolysis of different β-lactams in all MβLs. This study demonstrates the existence of a direct link between the conformation of this loop and the mechanistic features of the enzyme, bringing to light an unexplored function of active-site loops on MβLs.Fil: Palacios, Antonela Rocio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Mojica, María F.. Case Western Reserve University; Estados UnidosFil: Giannini, Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Taracila, Magdalena A.. Case Western Reserve University; Estados Unidos. Louis Stokes Veterans Affairs Medical Center; Estados UnidosFil: Bethel, Christopher R.. Louis Stokes Veterans Affairs Medical Center; Estados UnidosFil: Alzari, Pedro M.. Institut Pasteur de Paris; FranciaFil: Otero, Lisandro Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Klinke, Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Llarrull, Leticia Irene. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Bonomo, Robert A.. Case Western Reserve University; Estados UnidosFil: Vila, Alejandro Jose. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Novel Circulating miRNA Signatures for Early Detection of Pancreatic Neoplasia

OBJECTIVES: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) presents the lowest survival rate of all cancers because only 6% of patients reach five-year survival. Alterations in the expression of several microRNAs (miRNAs) occur in the tumor of PDAC and in preneoplastic lesions as the called intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN). Here, we aimed at identifying which miRNAs are significantly altered in liquid biopsies from patients with PDAC and IPMN to find new noninvasive biomarkers for early detection of PDAC. METHODS: We analyzed by real-time quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) the expression of 17 circulating miRNAs, previously found to be significantly overexpressed in tissue pancreatic neoplasms, in a set of 182 plasma samples (94 PDAC, 19 IPMN, 18 chronic pancreatitis, and 51 disease-free controls). Then, we analyzed CA19.9 levels in the same plasma set, and we assessed the diagnostic values of differentially expressed miRNAs, CA19.9, and all possible combinations. RESULTS: Of note, 16, 14, and 9 miRNAs were significantly increased in PDAC, IPMN, and chronic pancreatitis, respectively, compared with control plasmas. miR-21-5p, miR-33a-3p, miR-320a, and miR-93-5p showed the highest discriminating capacity for pancreatic neoplasia (PDAC or IPMN) with an area under the receiver operating characteristic curve (AUC) of 0.86, 0.85, 0.85, and 0.80, respectively. 2-miRNA combinations improved these performances reaching AUC = 0.90 for "miR-33a-3p+miR-320a." Addition of CA19.9 increased the diagnostic potential of miRNA signatures even further achieving an AUC of 0.95 (93% sensitivity and 85% specificity) for the combination of "miR-33a-3p+miR-320a+CA19.9." CONCLUSIONS: Novel signatures combining miRNAs and CA19.9 could be used as noninvasive biomarkers for early detection of PDAC