Growth of immobilized DNA by polymerase: bridging nanoelectrodes with individual dsDNA molecules

We present a method for controlled connection of gold electrodes with dsDNA molecules (locally on a chip) by utilizing polymerase to elongate single-stranded DNA primers attached to the electrodes. Thiol-modified oligonucleotides are directed and immobilized to nanoscale electrodes by means of dielectrophoretic trapping, and extended in a procedure mimicking PCR, finally forming a complete dsDNA molecule bridging the gap between the electrodes. The technique opens up opportunities for building from the bottom-up, for detection and sensing applications, and also for molecular electronics.Comment: 5 pages, 3 figures; Nanoscale (2011

Zebavidin - An avidin-like protein from zebrafish

The avidin protein family members are well known for their high affinity towards D-biotin and high structural stability. These properties make avidins valuable tools for a wide range of biotechnology applications. We have identified a new member of the avidin family in the zebrafish (Danio rerio) genome, hereafter called zebavidin. The protein is highly expressed in the gonads of both male and female zebrafish and in the gills of male fish, but our data suggest that zebavidin is not crucial for the developing embryo. Biophysical and structural characterisation of zebavidin revealed distinct properties not found in any previously characterised avidins. Gel filtration chromatography and native mass spectrometry suggest that the protein forms dimers in the absence of biotin at low ionic strength, but assembles into tetramers upon binding biotin. Ligand binding was analysed using radioactive and fluorescently labelled biotin and isothermal titration calorimetry. Moreover, the crystal structure of zebavidin in complex with biotin was solved at 2.4 Å resolution and unveiled unique ligand binding and subunit interface architectures; the atomic-level details support our physicochemical observations.Public Library of Science open acces

Bifunctional Avidin with Covalently Modifiable Ligand Binding Site

The extensive use of avidin and streptavidin in life sciences originates from the extraordinary tight biotin-binding affinity of these tetrameric proteins. Numerous studies have been performed to modify the biotin-binding affinity of (strept)avidin to improve the existing applications. Even so, (strept)avidin greatly favours its natural ligand, biotin. Here we engineered the biotin-binding pocket of avidin with a single point mutation S16C and thus introduced a chemically active thiol group, which could be covalently coupled with thiol-reactive molecules. This approach was applied to the previously reported bivalent dual chain avidin by modifying one binding site while preserving the other one intact. Maleimide was then coupled to the modified binding site resulting in a decrease in biotin affinity. Furthermore, we showed that this thiol could be covalently coupled to other maleimide derivatives, for instance fluorescent labels, allowing intratetrameric FRET. The bifunctional avidins described here provide improved and novel tools for applications such as the biofunctionalization of surfaces

Uusien molekyylityökalujen kehittäminen avidiineista, DNA:sta ja kitosaanista

Nanobioteknologia ja bionanoteknologia ovat suhteellisen uusia, nopeasti kehittyviä tieteenaloja, jotka hyödyntävät biomolekyylejä. Biomolekyylien luonnolliset ominaisuudet ja toiminta täytyy tuntea hyvin, jotta niitä voidaan hyödyntää moderneissa teknisissä sovelluksissa. Biomolekyylien ominaisuuksia täytyy myös usein muokata joko geneettisesti tai kemiallisesti, jotta ne soveltuvat tiettyyn käyttökohteeseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida ja muokata biomolekyylien ominaisuuksia, jotta niistä voitaisiin valmistaa molekyylityökaluja nanobioteknologian ja bionanoteknologian tarpeisiin. Avidiini-proteiinit valittiin muokattaviksi sen vuoksi, että niitä käytetään jo laajalti bioteknologian sovelluksissa, sillä ne sitovat poikkeuksellisen voimakkaasti pientä vitamiini-molekyyliä, D-biotiinia (Kd ~10-15 M). Tässä työssä muokattiin aiemmin kehitetyn kaksoisketjuavidiinin (dcAvd) toista ligandin sitoutumispaikkaa muodostamaan kovalentin sidoksen ligandin kanssa. Näin aikaansaatu uusi proteiini, dcAvd-Cys, kykenee sitoutumaan kahdenlaisten molekyylien, tioli-reaktiivisten sekä biotinyloitujen molekyylien kanssa samanaikaisesti, joten sitä voitaisiin hyödyntää molekyylien hallitussa immobilisoinnissa. Työssä määritettiin kahden avidiinin kiderakenteet suurella tarkkuudella. Rakenteen, biokemiallisen ja biofysikaalisen karakterisoinnin perusteella näiden proteiinien käyttäytyminen poikkeaa aiemmin tutkituista avidiineista. Tetrameerisen villityypin bradavidiinin C-terminaaliset aminohappotähteet vuorovaikuttavat viereisen monomeerin ligandinsitomistaskun kanssa, käyttäytyen kuten monomeerien välinen sisäinen ligandi. Tämä havainto johti bradavidiini-spesifisen Brad-tag:n kehittämiseen, ja Brad-tag:n osoitettiin olevan käyttökelpoinen affiniteettikahva (Kd ~2,5 × 10-5 M). Suurin osa tutkituista (strept)avidiineista on tetrameerisia tai dimeerisiä proteiineja, kun taas bradavidiini II:n oligomeerisuusaste osoittautui vaihtelevan ympäröivien olosuhteiden mukaan. Bradavidiini II:n heikkoa oligomerisoitumispyrkimystä voitaisiin hyödyntää fuusioproteiinien kehittämisessä. Avidiinien ohella tutkittiin kahta erilaista biomolekyylien muodostamaa kompleksia. Ensimmäiseksi hyödynnettiin deoksiribonukleiinihappojen (DNA) ominaisuuksia kehitettäessä määrätyn kokoinen, itsejärjestyvä DNA-rakenne (B–A–B-kompleksi). Kompleksi ohjattiin kullasta valmistettujen nanoelektrodien väliin dielektroforeesin ja tioli-kulta sidoksen avulla. Streptavidiinin avulla osoitettiin, että kompleksi voidaan funktionalisoida muilla molekyyleillä. B–A–B-kompleksin mitattu johtavuus oli lähes olematonta. Kehitetty kompleksi voisi toimia alustana, johon kyettäisiin tarkasti sijoittamaan muita molekyylielektroniikan komponentteja. Toiseksi hyödynnettiin kitosaanin ja DNA:n sähköstaattista vuorovaikutusta valmistettaessa kitosaani-DNA nanopartikkeleita geenien kuljettamiksi. Nanopartikkelit funktionalisoitiin fluoresoivilla leimoilla ja kohdentavilla peptideillä. Soluviljelyanalyysissä nanopartikkelit kulkeutuivat kohdesolujen sisään. Kokonaisuudessaan tässä työssä tuotettiin monipuolisia molekyylityökaluja, jotka perustuvat muokattuihin avidiineihin, itsejärjestäytyvään DNA-rakenteeseen ja kitosaani-DNA nanopartikkeleihin. Vaikka kehitettyjen työkalujen sovelluskohteet vaihtelevat biosensoripinnoista proteiinien tunnistamiseen ja molekyylitason elektroniikasta geenien kuljettamiseen, eri osatutkimuksissa käytettiin monia samoja menetelmiä ja materiaaleja. Tutkitut ja kehitetyt biomolekyylit lisäävät tietoa, jota tarvitaan parempien molekyylityökalujen valmistamisessa.Biomolecules have a central role in two relatively new, fast-developing scientific disciplines, nanobiotechnology and bionanotechnology. The properties and the behaviour of natural biomolecules need to be well studied and characterized in order to use them in modern technical applications. Quite often a genetic or chemical modification is needed to tailor the biomolecule suitable for a specific application. The aim of this doctoral thesis was to characterize and modify the properties of biomolecules in order to develop molecular tools for applications in nanobiotechnology and bionanotechnology. Avidin proteins were selected for modification as they are already widely used in biotechnology due to their extraordinary tight affinity for a small vitamin, D-biotin (Kd ~10-15 M). In this study, covalent ligand binding was engineered and applied to one binding site of a dual chain avidin (dcAvd). The resulting dcAvd-Cys enabled the subsequent attachment of two different kinds of molecules, thiol-reactive compounds and biotinylated compounds, to the same protein pseudotetramer. This molecule could be a valuable tool for the immobilization of molecules in a controlled way. The biochemical and biophysical characterization as well as the high-resolution crystallographic 3D-structures of two bradavidins revealed some behavioral traits atypical for avidins. In the tetrameric wild type bradavidin, the C-terminal amino acid residues interact with the ligand-binding site of the neighbouring monomer, thus acting as an intersubunit intrinsic ligand. This finding led to the development of a bradavidin specific Brad-tag, which was demonstrated to be applicable as an affinity tag (Kd ~2.5 × 10-5 M). Most of the characterized avidins are tetramers or dimers, whereas bradavidin II exists in a dynamic oligomeric state depending on the environment. The weak oligomerization tendency of bradavidin II may be of use in the development of fusion proteins. In addition to avidins, two biomolecular complexes were studied. First, the self-assembling property of deoxyribonucleic acid (DNA) was used to develop a defined sized, self-assembling DNA structure (B–A–B-complex) based on triple crossover (TX) tiles. Dielectrophoresis was used to trap and immobilize the B–A–B-complex between two gold-nanoelectrodes via thiol-gold bonding. The feasibility to functionalize the complex was demonstrated using streptavidin. The measured direct conductivity of the B–A–B-complex was insignificant, and therefore, the complex may find use as a scaffold material for the precise assembly of other components in molecular electronics. Second, the electrostatic interaction between chitosan and DNA was used to create chitosan-DNA nanoparticles. These were studied as potential carriers for gene-delivery applications. The nanoparticles were functionalized by fluorescent labels and targeting peptides. A cell culture analysis demonstrated that the nanoparticles can be internalized by cells. In conclusion, this thesis study produced versatile biomolecular tools based on modified avidins, a self-assembling DNA-complex and chitosan-DNA nanoparticles. Although the developed tools may find use in somewhat different end-point applications ranging from biosensor surfaces to protein detection, and from molecular electronics to gene delivery, the methods and materials used were similar in all of the studies. Altogether, the studied and engineered biomolecules provide valuable knowledge for the future development of biomolecular tools

Uusien molekyylityökalujen kehittäminen avidiineista, DNA:sta ja kitosaanista

Nanobioteknologia ja bionanoteknologia ovat suhteellisen uusia, nopeasti kehittyviä tieteenaloja, jotka hyödyntävät biomolekyylejä. Biomolekyylien luonnolliset ominaisuudet ja toiminta täytyy tuntea hyvin, jotta niitä voidaan hyödyntää moderneissa teknisissä sovelluksissa. Biomolekyylien ominaisuuksia täytyy myös usein muokata joko geneettisesti tai kemiallisesti, jotta ne soveltuvat tiettyyn käyttökohteeseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida ja muokata biomolekyylien ominaisuuksia, jotta niistä voitaisiin valmistaa molekyylityökaluja nanobioteknologian ja bionanoteknologian tarpeisiin. Avidiini-proteiinit valittiin muokattaviksi sen vuoksi, että niitä käytetään jo laajalti bioteknologian sovelluksissa, sillä ne sitovat poikkeuksellisen voimakkaasti pientä vitamiini-molekyyliä, D-biotiinia (Kd ~10-15 M). Tässä työssä muokattiin aiemmin kehitetyn kaksoisketjuavidiinin (dcAvd) toista ligandin sitoutumispaikkaa muodostamaan kovalentin sidoksen ligandin kanssa. Näin aikaansaatu uusi proteiini, dcAvd-Cys, kykenee sitoutumaan kahdenlaisten molekyylien, tioli-reaktiivisten sekä biotinyloitujen molekyylien kanssa samanaikaisesti, joten sitä voitaisiin hyödyntää molekyylien hallitussa immobilisoinnissa. Työssä määritettiin kahden avidiinin kiderakenteet suurella tarkkuudella. Rakenteen, biokemiallisen ja biofysikaalisen karakterisoinnin perusteella näiden proteiinien käyttäytyminen poikkeaa aiemmin tutkituista avidiineista. Tetrameerisen villityypin bradavidiinin C-terminaaliset aminohappotähteet vuorovaikuttavat viereisen monomeerin ligandinsitomistaskun kanssa, käyttäytyen kuten monomeerien välinen sisäinen ligandi. Tämä havainto johti bradavidiini-spesifisen Brad-tag:n kehittämiseen, ja Brad-tag:n osoitettiin olevan käyttökelpoinen affiniteettikahva (Kd ~2,5 × 10-5 M). Suurin osa tutkituista (strept)avidiineista on tetrameerisia tai dimeerisiä proteiineja, kun taas bradavidiini II:n oligomeerisuusaste osoittautui vaihtelevan ympäröivien olosuhteiden mukaan. Bradavidiini II:n heikkoa oligomerisoitumispyrkimystä voitaisiin hyödyntää fuusioproteiinien kehittämisessä. Avidiinien ohella tutkittiin kahta erilaista biomolekyylien muodostamaa kompleksia. Ensimmäiseksi hyödynnettiin deoksiribonukleiinihappojen (DNA) ominaisuuksia kehitettäessä määrätyn kokoinen, itsejärjestyvä DNA-rakenne (B–A–B-kompleksi). Kompleksi ohjattiin kullasta valmistettujen nanoelektrodien väliin dielektroforeesin ja tioli-kulta sidoksen avulla. Streptavidiinin avulla osoitettiin, että kompleksi voidaan funktionalisoida muilla molekyyleillä. B–A–B-kompleksin mitattu johtavuus oli lähes olematonta. Kehitetty kompleksi voisi toimia alustana, johon kyettäisiin tarkasti sijoittamaan muita molekyylielektroniikan komponentteja. Toiseksi hyödynnettiin kitosaanin ja DNA:n sähköstaattista vuorovaikutusta valmistettaessa kitosaani-DNA nanopartikkeleita geenien kuljettamiksi. Nanopartikkelit funktionalisoitiin fluoresoivilla leimoilla ja kohdentavilla peptideillä. Soluviljelyanalyysissä nanopartikkelit kulkeutuivat kohdesolujen sisään. Kokonaisuudessaan tässä työssä tuotettiin monipuolisia molekyylityökaluja, jotka perustuvat muokattuihin avidiineihin, itsejärjestäytyvään DNA-rakenteeseen ja kitosaani-DNA nanopartikkeleihin. Vaikka kehitettyjen työkalujen sovelluskohteet vaihtelevat biosensoripinnoista proteiinien tunnistamiseen ja molekyylitason elektroniikasta geenien kuljettamiseen, eri osatutkimuksissa käytettiin monia samoja menetelmiä ja materiaaleja. Tutkitut ja kehitetyt biomolekyylit lisäävät tietoa, jota tarvitaan parempien molekyylityökalujen valmistamisessa.Biomolecules have a central role in two relatively new, fast-developing scientific disciplines, nanobiotechnology and bionanotechnology. The properties and the behaviour of natural biomolecules need to be well studied and characterized in order to use them in modern technical applications. Quite often a genetic or chemical modification is needed to tailor the biomolecule suitable for a specific application. The aim of this doctoral thesis was to characterize and modify the properties of biomolecules in order to develop molecular tools for applications in nanobiotechnology and bionanotechnology. Avidin proteins were selected for modification as they are already widely used in biotechnology due to their extraordinary tight affinity for a small vitamin, D-biotin (Kd ~10-15 M). In this study, covalent ligand binding was engineered and applied to one binding site of a dual chain avidin (dcAvd). The resulting dcAvd-Cys enabled the subsequent attachment of two different kinds of molecules, thiol-reactive compounds and biotinylated compounds, to the same protein pseudotetramer. This molecule could be a valuable tool for the immobilization of molecules in a controlled way. The biochemical and biophysical characterization as well as the high-resolution crystallographic 3D-structures of two bradavidins revealed some behavioral traits atypical for avidins. In the tetrameric wild type bradavidin, the C-terminal amino acid residues interact with the ligand-binding site of the neighbouring monomer, thus acting as an intersubunit intrinsic ligand. This finding led to the development of a bradavidin specific Brad-tag, which was demonstrated to be applicable as an affinity tag (Kd ~2.5 × 10-5 M). Most of the characterized avidins are tetramers or dimers, whereas bradavidin II exists in a dynamic oligomeric state depending on the environment. The weak oligomerization tendency of bradavidin II may be of use in the development of fusion proteins. In addition to avidins, two biomolecular complexes were studied. First, the self-assembling property of deoxyribonucleic acid (DNA) was used to develop a defined sized, self-assembling DNA structure (B–A–B-complex) based on triple crossover (TX) tiles. Dielectrophoresis was used to trap and immobilize the B–A–B-complex between two gold-nanoelectrodes via thiol-gold bonding. The feasibility to functionalize the complex was demonstrated using streptavidin. The measured direct conductivity of the B–A–B-complex was insignificant, and therefore, the complex may find use as a scaffold material for the precise assembly of other components in molecular electronics. Second, the electrostatic interaction between chitosan and DNA was used to create chitosan-DNA nanoparticles. These were studied as potential carriers for gene-delivery applications. The nanoparticles were functionalized by fluorescent labels and targeting peptides. A cell culture analysis demonstrated that the nanoparticles can be internalized by cells. In conclusion, this thesis study produced versatile biomolecular tools based on modified avidins, a self-assembling DNA-complex and chitosan-DNA nanoparticles. Although the developed tools may find use in somewhat different end-point applications ranging from biosensor surfaces to protein detection, and from molecular electronics to gene delivery, the methods and materials used were similar in all of the studies. Altogether, the studied and engineered biomolecules provide valuable knowledge for the future development of biomolecular tools

Microwave hydrolysis, as a sustainable approach in the processing of seaweed for protein and nanocellulose management

publishedVersio

Avidin-Conjugated Nanofibrillar Cellulose Hydrogel Functionalized with Biotinylated Fibronectin and Vitronectin Promotes 3D Culture of Fibroblasts

The future success of physiologically relevant three-dimensional (3D) cell/tissue models is dependent on the development of functional biomaterials, which can provide a well-defined 3D environment instructing cellular behavior. To establish a platform to produce tailored hydrogels, we conjugated avidin (Avd) to anionic nanofibrillar cellulose (aNFC) and demonstrated the use of the resulting Avd-NFC hydrogel for 3D cell culture, where Avd-NFC allows easy functionalization via biotinylated molecules. Avidin was successfully conjugated to nanocellulose and remained functional, as demonstrated by electrophoresis and titration with fluorescent biotin. Rheological analysis indicated that Avd-NFC retained shear-thinning and gel-forming properties. Topological characterization using AFM revealed the preserved fiber structure and confirmed the binding of biotinylated vitronectin (B-VN) on the fiber surface. The 3D cell culture experiments with mouse embryonic fibroblasts demonstrated the performance of Avd-NFC hydrogels functionalized with biotinylated fibronectin (B-FN) and B-VN. Cells cultured in Avd-NFC hydrogels functionalized with B-FN or B-VN formed matured integrin-mediated adhesions, indicated by phosphorylated focal adhesion kinase. We observed significantly higher cell proliferation rates when biotinylated proteins were bound to the Avd-NFC hydrogel compared to cells cultured in Avd-NFC alone, indicating the importance of the presence of adhesive sites for fibroblasts. The versatile Avd-NFC allows the easy functionalization of hydrogels with virtually any biotinylated molecule and may become widely utilized in 3D cell/tissue culture applications.publishedVersionPeer reviewe

Design of modular gellan gum hydrogel functionalized with avidin and biotinylated adhesive ligands for cell culture applications

This article proposes the coupling of the recombinant protein avidin to the polysaccharide gellan gum to create a modular hydrogel substrate for 3D cell culture and tissue engineering. Avidin is capable of binding biotin, and thus biotinylated compounds can be tethered to the polymer network to improve cell response. The avidin is successfully conjugated to gellan gum and remains functional as shown with fluorescence titration and electrophoresis (SDS-PAGE). Self-standing hydrogels were formed using bioamines and calcium chloride, yielding long-term stability and adequate stiffness for 3D cell culture, as confirmed with compression testing. Human fibroblasts were successfully cultured within the hydrogel treated with biotinylated RGD or biotinylated fibronectin. Moreover, human bone marrow stromal cells were cultured with hydrogel treated with biotinylated RGD over 3 weeks. We demonstrate a modular and inexpensive hydrogel scaffold for cell encapsulation that can be equipped with any desired biotinylated cell ligand to accommodate a wide range of cell types.publishedVersionPeer reviewe

Biofunctional hybrid materials: bimolecular organosilane monolayers on FeCr alloys

acceptedVersionPeer reviewe