Nanobioteknologia ja bionanoteknologia ovat suhteellisen uusia, nopeasti kehittyviä tieteenaloja, jotka hyödyntävät biomolekyylejä. Biomolekyylien luonnolliset ominaisuudet ja toiminta täytyy tuntea hyvin, jotta niitä voidaan hyödyntää moderneissa teknisissä sovelluksissa. Biomolekyylien ominaisuuksia täytyy myös usein muokata joko geneettisesti tai kemiallisesti, jotta ne soveltuvat tiettyyn käyttökohteeseen.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida ja muokata biomolekyylien ominaisuuksia, jotta niistä voitaisiin valmistaa molekyylityökaluja nanobioteknologian ja bionanoteknologian tarpeisiin. Avidiini-proteiinit valittiin muokattaviksi sen vuoksi, että niitä käytetään jo laajalti bioteknologian sovelluksissa, sillä ne sitovat poikkeuksellisen voimakkaasti pientä vitamiini-molekyyliä, D-biotiinia (Kd ~10-15 M). Tässä työssä muokattiin aiemmin kehitetyn kaksoisketjuavidiinin (dcAvd) toista ligandin sitoutumispaikkaa muodostamaan kovalentin sidoksen ligandin kanssa. Näin aikaansaatu uusi proteiini, dcAvd-Cys, kykenee sitoutumaan kahdenlaisten molekyylien, tioli-reaktiivisten sekä biotinyloitujen molekyylien kanssa samanaikaisesti, joten sitä voitaisiin hyödyntää molekyylien hallitussa immobilisoinnissa.
Työssä määritettiin kahden avidiinin kiderakenteet suurella tarkkuudella. Rakenteen, biokemiallisen ja biofysikaalisen karakterisoinnin perusteella näiden proteiinien käyttäytyminen poikkeaa aiemmin tutkituista avidiineista. Tetrameerisen villityypin bradavidiinin C-terminaaliset aminohappotähteet vuorovaikuttavat viereisen monomeerin ligandinsitomistaskun kanssa, käyttäytyen kuten monomeerien välinen sisäinen ligandi. Tämä havainto johti bradavidiini-spesifisen Brad-tag:n kehittämiseen, ja Brad-tag:n osoitettiin olevan käyttökelpoinen affiniteettikahva (Kd ~2,5 × 10-5 M). Suurin osa tutkituista (strept)avidiineista on tetrameerisia tai dimeerisiä proteiineja, kun taas bradavidiini II:n oligomeerisuusaste osoittautui vaihtelevan ympäröivien olosuhteiden mukaan. Bradavidiini II:n heikkoa oligomerisoitumispyrkimystä voitaisiin hyödyntää fuusioproteiinien kehittämisessä.
Avidiinien ohella tutkittiin kahta erilaista biomolekyylien muodostamaa kompleksia. Ensimmäiseksi hyödynnettiin deoksiribonukleiinihappojen (DNA) ominaisuuksia kehitettäessä määrätyn kokoinen, itsejärjestyvä DNA-rakenne (B–A–B-kompleksi). Kompleksi ohjattiin kullasta valmistettujen nanoelektrodien väliin dielektroforeesin ja tioli-kulta sidoksen avulla. Streptavidiinin avulla osoitettiin, että kompleksi voidaan funktionalisoida muilla molekyyleillä. B–A–B-kompleksin mitattu johtavuus oli lähes olematonta. Kehitetty kompleksi voisi toimia alustana, johon kyettäisiin tarkasti sijoittamaan muita molekyylielektroniikan komponentteja. Toiseksi hyödynnettiin kitosaanin ja DNA:n sähköstaattista vuorovaikutusta valmistettaessa kitosaani-DNA nanopartikkeleita geenien kuljettamiksi. Nanopartikkelit funktionalisoitiin fluoresoivilla leimoilla ja kohdentavilla peptideillä. Soluviljelyanalyysissä nanopartikkelit kulkeutuivat kohdesolujen sisään.
Kokonaisuudessaan tässä työssä tuotettiin monipuolisia molekyylityökaluja, jotka perustuvat muokattuihin avidiineihin, itsejärjestäytyvään DNA-rakenteeseen ja kitosaani-DNA nanopartikkeleihin. Vaikka kehitettyjen työkalujen sovelluskohteet vaihtelevat biosensoripinnoista proteiinien tunnistamiseen ja molekyylitason elektroniikasta geenien kuljettamiseen, eri osatutkimuksissa käytettiin monia samoja menetelmiä ja materiaaleja. Tutkitut ja kehitetyt biomolekyylit lisäävät tietoa, jota tarvitaan parempien molekyylityökalujen valmistamisessa.Biomolecules have a central role in two relatively new, fast-developing scientific disciplines, nanobiotechnology and bionanotechnology. The properties and the behaviour of natural biomolecules need to be well studied and characterized in order to use them in modern technical applications. Quite often a genetic or chemical modification is needed to tailor the biomolecule suitable for a specific application.
The aim of this doctoral thesis was to characterize and modify the properties of biomolecules in order to develop molecular tools for applications in nanobiotechnology and bionanotechnology. Avidin proteins were selected for modification as they are already widely used in biotechnology due to their extraordinary tight affinity for a small vitamin, D-biotin (Kd ~10-15 M). In this study, covalent ligand binding was engineered and applied to one binding site of a dual chain avidin (dcAvd). The resulting dcAvd-Cys enabled the subsequent attachment of two different kinds of molecules, thiol-reactive compounds and biotinylated compounds, to the same protein pseudotetramer. This molecule could be a valuable tool for the immobilization of molecules in a controlled way.
The biochemical and biophysical characterization as well as the high-resolution crystallographic 3D-structures of two bradavidins revealed some behavioral traits atypical for avidins. In the tetrameric wild type bradavidin, the C-terminal amino acid residues interact with the ligand-binding site of the neighbouring monomer, thus acting as an intersubunit intrinsic ligand. This finding led to the development of a bradavidin specific Brad-tag, which was demonstrated to be applicable as an affinity tag (Kd ~2.5 × 10-5 M). Most of the characterized avidins are tetramers or dimers, whereas bradavidin II exists in a dynamic oligomeric state depending on the environment. The weak oligomerization tendency of bradavidin II may be of use in the development of fusion proteins.
In addition to avidins, two biomolecular complexes were studied. First, the self-assembling property of deoxyribonucleic acid (DNA) was used to develop a defined sized, self-assembling DNA structure (B–A–B-complex) based on triple crossover (TX) tiles. Dielectrophoresis was used to trap and immobilize the B–A–B-complex between two gold-nanoelectrodes via thiol-gold bonding. The feasibility to functionalize the complex was demonstrated using streptavidin. The measured direct conductivity of the B–A–B-complex was insignificant, and therefore, the complex may find use as a scaffold material for the precise assembly of other components in molecular electronics. Second, the electrostatic interaction between chitosan and DNA was used to create chitosan-DNA nanoparticles. These were studied as potential carriers for gene-delivery applications. The nanoparticles were functionalized by fluorescent labels and targeting peptides. A cell culture analysis demonstrated that the nanoparticles can be internalized by cells.
In conclusion, this thesis study produced versatile biomolecular tools based on modified avidins, a self-assembling DNA-complex and chitosan-DNA nanoparticles. Although the developed tools may find use in somewhat different end-point applications ranging from biosensor surfaces to protein detection, and from molecular electronics to gene delivery, the methods and materials used were similar in all of the studies. Altogether, the studied and engineered biomolecules provide valuable knowledge for the future development of biomolecular tools
