Lokalisationsmechanismen der ATPase des Virulenz-assoziierten Typ VI Sekretionssystems in Burkholderia thailandensis

Das Typ VI Sekretionssystem (T6SS) besteht aus einem in der Membran verankerten kontraktilen zytoplasmatischen Tubus, der eine Nadel in Nachbarzellen treibt um toxische Effektoren zu sekretieren. Der kontrahierte Tubus wird von der AAA+ ATPase ClpV entfaltet und recycelt. Immer mehr Studien zeigen, dass die Lokalisation des T6SS in der Bakterienzelle von dem Typ der Zielzelle bedingt wird. T6SS, die gegen eukaryotische Zellen wirken, zeigen eine polare Lokalisation, wohingegen T6SS, die Bakterien angreifen, eine zufällige Lokalisation aufweisen. Wie die T6SS-Proteine den Assemblierungsort erreichen, ist jedoch unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe des Modellorganismus Burkholderia thailandensis erste Informationen über die grundlegenden Lokalisationsmechanismen der T6SS-Komponenten zu erlangen. B. thailandensis besitzt mehrere T6SS. Unter anderem das T6SS-1, welches Effektoren in andere Bakterien transloziert und das T6SS-5, ein essentieller Virulenzfaktor der Wirtszellen manipuliert. Vorausgegangene Arbeiten haben gezeigt, dass die ATPasen dieser beiden Sekretionssysteme, ClpV-1 und ClpV-5, diskrete Fokusse bilden, die eine zufällige bzw. polare Lokalisation aufweisen. ClpV-1-GFP-Fokusse weisen eine hohe Dynamik auf, die vermutlich den Abbau von kontrahierten Tubuli anzeigt. Im Gegensatz dazu sind ClpV-5-sfGFP-Fokusse statisch am Pol lokalisiert, was auf eine niedrigere Aktivität schließen lässt. Zunächst wurde die Rolle des T6SS-Apparates bei der Lokalisation von ClpV bestimmt. Dazu wurden B. thailandensis Mutanten mit vollständigen T6SS-1 und T6SS-5 Gencluster-Deletionen hergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die diskrete, singuläre Fokusbildung von ClpV-1-GFP in der ∆T6SS-1-Mutante signifikant reduziert war, was bedeutet, dass ClpV-1 ohne T6SS-1-Proteine nicht lokalisieren kann. Im Gegensatz dazu lokalisiert ClpV-5-sfGFP auch in Abwesenheit der T6SS-5-Proteine am Pol. Das könnte bedeuten, dass es mit einem anderen Faktor interagiert, um zum Pol zu gelangen. Die Ergebnisse zeigen, dass die T6SS ATPasen unterschiedliche Informationen über die subzelluläre Lokalisation enthalten können. Weiterhin konnte die polare Lokalisation von ClpV-5 in der ∆T6SS-5 Mutante sowohl während der Infektion von Wirtszellen als auch außerhalb in Kulturmedium beobachtet werden. Ein intrazelluläres Signal der Wirtszelle ist daher nicht in Lokalisation von ClpV-5 involviert. Andere zytoplasmatische T6SS-5-Proteine wie TssK-5 und TssC-5 zeigten eine diffuse Verteilung in der ∆T6SS-5-Mutante. Die Beeinträchtigung von zellulären Faktoren, die in die räumliche Organisation von Bakterienzellen involviert sind, wie beispielsweise das Zytoskelettprotein MreB, hatte keinen Einfluss auf die Fokusbildung von ClpV-5 und ClpV-1. Da das T6SS ein kontaktabhängiges System ist und das Signal zur Kontraktion von T6SS-5 und T6SS-1 unbekannt ist, wurde der Einfluss von Oberflächenkontakt auf die Verteilung von ClpV-5 und ClpV-1 untersucht. Dafür wurden die Bakterien für unterschiedliche Zeitintervalle auf Agarosepads aufgetropft, um Oberflächenkontakt zu generieren. Als Kontrolle wurden die Bakterien in Flüssigkultur mit Paraformaldehyd fixiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Oberflächenkontakt nicht essentiell für die polare Lokalisation von ClpV-5 ist, diese aber induziert. Nach längerer Inkubation änderte sich die diffuse Verteilung von TssK-5-sfGFP zu diskreter Fokusbildung. Die Fokusse waren zufällig lokalisiert und scheinen unspezifisch zu sein. In B. thailandensis-Bakterien, die eine chromosomale clpV-1-gfp Fusion exprimierten und länger auf Agarosepads aufgetropft waren, konnte ein ClpV-1-GFP-Signal beobachtet werden. Die gleiche Mutante ohne Oberflächenkontakt zeigte kein GFP-Signal. Hieraus lässt sich schließen, dass Oberflächenkontakt ein Signal zur Expression von clpV-1 und vermutlich des gesamten T6SS-1-Genclusters darstellt. Zusammenfassend sind in dieser Arbeit neue Erkenntnisse zur Lokalisation von ClpV ATPasen von T6SS, die gegen Bakterien und Wirtszellen gerichtet sind, gewonnen worden

The Burkholderia Type VI Secretion System 5: Composition, Regulation and Role in Virulence

The soil saprophyte and Tier I select agent Burkholderia pseudomallei can cause rapidly fatal infections in humans and animals. The capability of switching to an intracellular life cycle during infection appears to be a decisive trait of B. pseudomallei for causing disease. B. pseudomallei harbors multiple type VI secretion systems (T6SSs) orthologs of which are present in the surrogate organism Burkholderia thailandensis. Upon host cell entry and vacuolar escape into the cytoplasm, B. pseudomallei and B. thailandensis manipulate host cells by utilizing the T6SS-5 (also termed T6SS1) to form multinucleated giant cells for intercellular spread. Disruption of the T6SS-5 in B. thailandensis causes a drastic attenuation of virulence in wildtype but not in mice lacking the central innate immune adapter protein MyD88. This result suggests that the T6SS-5 is deployed by the bacteria to overcome innate immune responses. However, important questions in this field remain unsolved including the mechanism underlying T6SS-5 activity and its physiological role during infection. In this review, we summarize the current knowledge on the components and regulation of the T6SS-5 as well as its role in virulence in mammalian hosts

Who do you think is in control in addiction?:a pilot study on drug-related locus of control beliefs

OBJECTIVES: The drug-related locus of control scale (DR-LOC) is a new instrument for assessing a person’s belief of “being in control” in situations involving drug abuse. It consists of 16-item pairs presented in a forced-choice format, based on the conceptual model outlined by Rotter. The model characterizes the extent to which a person believes that the outcome of an event is under their personal control (internal locus of control) or the influence of external circumstances (external locus of control). METHODS: A total of 592 volunteers completed the DR-LOC and the Rotter’s I-E scale. Approximately half of the respondents were enrolled in a drug treatment program for opiates, stimulants and/or alcohol dependence (n = 282), and the remainder (n = 310) had no history of drug dependence. RESULTS: Factor analysis of DR-LOC items revealed 2 factors reflecting control beliefs regarding (i) the successful recovery from addiction, and (ii) decisions to use drugs. The extent to which a person attributes control in drug-related situations is significantly influenced by their personal or professional experiences with drug addiction. Drug-dependent individuals have a greater internal sense of control with regard to addiction recovery or drug-taking behaviors than health professionals and/or non-dependent control volunteers. CONCLUSIONS: The DR-LOC has shown to effectively translate generalized expectancies of control into a measure of control expectancies for drug-related situations, making it more sensitive for drug-dependent individuals than Rotter’s I-E scale. Further research is needed to demonstrate its performance at discriminating between heterogeneous clinical groups such as between treatment-seeking versus non–treatment-seeking drug users