Novel C11 amino derivatives of cryptolepine : synthesis and in vitro studies with DNA and haeme

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010Malaria is one of the most widespread infectious diseases of our time. The global malaria map has been shrinking over the past 60 years, but today more people are at risk of suffering from malaria than any other time in history. In the past few years malaria has once again attracted more attention, partly because it is recognized that malaria spread in sub-Saharan Africa has increased in the recent years, mainly due to the development of drug resistances. Cryptolepine (1), is an indoloquinoline alkaloid, extracted from the West African climbing shrub Cryptolepis sanguinolenta (Lindl.) Schltr, a traditional herb used in folk medicine for the treatment of malaria. Several authors hypothesized that the mechanism of action of cryptolepine could be by inhibition of haemozoin formation in the digestive vacuole (DV) of the parasite, however in a microscopic fluorescence study, the indoloquinoline chromophore, was suggested to accumulate into specific parasite structures that could correspond to the parasite nuclei, and thus justifying its activity due to cytotoxic effects on DNA and topoisomerase II activity. Cryptolepine derivatives (3) have been synthesized through the incorporation of basic side-chains in the C-11 position of the 10H-indolo[3,2-b]quinoline scaffold and evaluated for their antiplasmodial and cytotoxicity properties. The derivative containing a conformationally restricted piperidine sidechain (3n) presented IC50 values of 23-44 nM against chloroquine resistant strains and a selectivity index value of ca 1400, i.e. a 1000-fold improvement in selectivity when compared with 1. The introduced side chains are weakly basic, with pKa values in the terminal amine functionality ranging from 5.2 to 12.5, and are predicted to promote accumulation inside the DV to an extent similar to that of chloroquine. All compounds within this series showed the ability to interact with monomeric haematin (FPIX-OH), with a stoichiometry of 1:1 (3:FPIX-OH) and with association constants (Kass) values between 0.062 and 0.41 x106 M-1, comparable to chloroquine (Kass = 0.085 x106 M-1). The complex stabilization is assured by π-π stacking interactions modulated by the aromatic core, and H-bond between the terminal amine side chain and haematin carboxylate anions, thus capable to inhibit haemozoin formation in DV. However, localization studies of compound 3n inside parasite blood stages suggest an additional mechanism of action, like interactions with DNA, besides inhibition of haemozoin crystal growth. Cryptolepine derivatives (3) bind strongly to double-stranded d(GATCCTAGGATC)2 oligonucleotide with association constants ranging from 105 M-1 to 107 M-1. Furthermore, molecular docking simulations showed that, in contrast with 1, compounds 3 are predicted to not intercalate into DNA double helix, binding essentially to single- and double-stranded DNA, with a stoichiometry of 2:1 (3:DNA), through electrostatic and H-bonding interaction involving charged nitrogens. In order to explore the indolo[3,2-b]quinolin-11-one (quindolone) scaffold (4), and get new antimalarial chemotypes, we decided to synthesize a series of quindolones derivatives (5), targeting malaria parasite digestive vacuole and haeme detoxification pathway, through the introduction of N,N diethylethanamine in the indolo[3,2-b]quinoline aromatic nucleus (N5,N10-alkylation). This reaction gave N,O- (94), N,N- (5) and O-(95) alkylated products containing two or one basic side-chains, which were evaluated for antiplasmodial activity against chloroquine-resistant P. falciparum W2 strain and cytotoxicity for HepG2 A16 hepatic cells. By incorporating alkylamine side chains and chlorine atoms in the quindolone nucleus we transformed the inactive tetracyclic parent quindolones (4, 91a and 91b) into moderate or highly active and selective compounds to the resistant P. falciparum W2 strain, with IC50 ranging from 51 to 2638 nM and with selectivity ratios up to 98. All the quindolone derivatives in the series showed the ability to complex FPIX-OH (1:1 stoichiometry) with associations constants (Kass) ranging from 0,074 to 0,14 x106 M-1, being the main intermolecular interactions due to π-π stacking interactions and H-bond between derivatives and haematin. Cryptolepine and the new antimalarial chemotype, quindolone, are suitable scaffolds for the design of active and selective compounds targeting parasite haemozoin detoxification pathway, with potential for development as antimalarial agents.A malária ou paludismo é uma doença infecciosa provocada por parasitas do género Plasmodium e transmitida pela picada do mosquito fêmea do género Anopheles. A malária é uma das infecções mais difundida por todo o mundo. Apesar propagação ter diminuído nos últimos 50 anos, nos dias de hoje há mais pessoas em risco de contaminação com malária do que em qualquer outra época da história. Em 2008, a malária era endémica em 108 países, contando com cerca de 247 milhões de casos reportados, 3,3 mil milhões de pessoas em risco. Anualmente, entre 1 a 3 milhões de casos culminam em morte, dos quais, muitos são crianças com idade inferior a 5 anos. A malária é a principal causa de morte infantil em África, sendo que 60 % dos novos casos registados todos os anos ocorrem na África sub-Sahariana, onde ocorrem 90 % dos casos fatais de malária. Para além de ser um grave problema de saúde pública, a malária é também um problema sócio-económico, não só devido ao elevado investimento efectuado na prevenção e tratamento, mas também devido a custos indirectos resultantes da perda de productividade que advêm da elevada morbilidade e mortalidade. No entanto, recentemente a malária voltou a chamar a atenção da comunidade, muito porque foi reconhecido que o número de casos reportados em África tem aumentado nos últimos anos devido ao aumento de fenómenos de resistência nos parasitas aos fármacos utilizados para tratamento da infecção. Apesar da enorme variedade de compostos com actividade antimalárica, a sua eficácia contínua no entanto a ser reduzida devido aos fenómenos de resistência associados. A cloroquina (2) é uma 4- amionoquinolina sintetizada em 1934 e tem sido um dos pilares do tratamento da malária nos últimos 60 anos, sendo de consenso geral, que a sua actividade antimalárica se deva à inibição da formação do cristal de hemozoína no vacúolo digestivo do parasita. No organismo humano, o parasita ingere hemoglobina e digere-a, libertando os amino ácidos necessários para o seu desenvolvimento, e o heme, tóxico para o parasita. Este heme é então biocristalizado pelo parasita a hemozoina, um cristal inerte e não tóxico. A cloroquina, devido às suas propriedades básicas, apresenta a capacidade de se acumular no interior do vacúolo digestivo acídico e formar complexos estáveis cloroquina:heme, através de interacções π-π entre os anéis aromáticos, impedindo assim a formação da hemozoina e originando a morte do parasita. Vários autores referem ainda que a cloroquina apresenta também a capacidade de complexar com as faces em crescimento do cristal de hemozoina, inibindo assim o processo de cristalização. Nos últimos 30 anos, extractos de uma enorme variedade de espécies de plantas, incluindo muitas utilizadas na medicinal tradicional, têm sido avaliadas in vitro quanto à sua actividade antimalárica. O alcalóide criptolepina (1), constituinte maioritário da raíz da Cryptolepis sanguinolenta, um arbusto trepador africano normalmente utilizado na medicina tradicional para tratamento da malária, demonstrou possuir propriedades antiplasmodicas equivalentes à cloroquina. A criptolepina parece exercer as propriedades antiplasmodicas devido à capacidade de inibir a formação da hemozoina, tal como a cloroquina, ligando-se ao heme e bloqueando assim o mecanismo de destoxificação do parasita. No entanto, a criptolepina é também um agente intercalante de cadeias de ADN ricas em guanina (G) e citosina (C), e tendo preferência por sequências CC não alternadas. Assim, a criptolepina apresenta propriedades citotóxicas devido à inibição da topoisomerase II e da síntese do ADN. Estas propriedades citotóxicas podem também estar na origem da actividade antiplasmódica uma vez que, um estudo de localização intracelular em eritrócitos infectados com P. falciparum, revelou que o alcalóide se acumula em estruturas no interior do parasita que poderão corresponder ao núcleo. Neste trabalho foram sintetizados 25 análogos da criptolepina (3) com cadeias laterais diaminoalquílicas, na posição C11 do núcleo aromático da indolo[3,2-b]quinolina e avaliados quanto as suas propriedades antiplasmodicas e citotóxicas em linhas celulares de mamífero. O análogo com uma cadeia lateral de piperidina (3n), apresentou uma actividade antiplasmódica (IC50) variando entre 23 e 44 nM, contra diferentes estripes resistentes à cloroquina, e um índice de selectividade de aproximadamente 1400, representando um aumento de cerca de 1000 vezes quando comparado com 1. Os nossos estudos sugerem que a introdução de cadeias laterais com aminas terminais basicas, apresentando valores de pKa variando entre 5,2 e 12,5, promove a acumulação dos compostos no interior do vacúolo digestivo do parasita, em níveis de concentração semelhantes aos da cloroquina. Todos os análogos da criptolepina sintetizados apresentam a capacidade de formar complexos com o monómero da hematina (FPIX-OH), com constantes de associação (Kass) variando entre 0,062 e 0,41 x106 M-1, semelhante à constante de associação determinada para a cloroquina (Kass = 0,085 x106 M-1). Os complexos são estabilizados maioritariamente através de interacções π-π entre o núcleo aromático da indolo[3,2-b]quinolina e o núcleo porfirínico da hematina. Estudos de modelação molecular revelaram também que os azotos protonados nas aminas terminais das cadeias laterais podem formar pontes de hidrogénio com os iões carboxilato da hematina. Estes resultados demonstraram que os novos análogos da criptolepina apresentam a capacidade de complexar com a FPIX-OH e inibir a formação da hemozoina. No entanto, o estudo de localização intracelular realizado por microscopia de fluorescência em eritrócitos infectados com P. falciparum, demonstrou que os análogos da criptolepina também apresentam a capacidade de se acumularem no núcleo do parasita e assim, potenciar a actividade antiplasmódica. De modo a avaliar a capacidade de 3 para interagir com estruturas de ADN, foram realizados estudos de interacção com um oligonucleótido de cadeia única d(5’-GCCAAACACAGAATCG-3’) e de cadeia dupla d(GATCCTAGGATC)2. Os compostos 3 apresentaram forte capacidade de complexação com ambas as estruturas de DNA e valores de constante de associação (Kass) variando entre 105 M-1 e 107 M-1. Estudos de modelação molecular com estruturas de ADN de hélice duplas semelhante à utilizada no ensaios in vitro, demonstraram que os compostos não são agentes intercalantes, tal como verificado para a criptolepina, mas ligam-se à fenda menor/maior, com uma estequiometria 2:1 (análogo da criptolepina:ADN) e interagem preferencialmente com a cadeia de fosfatos através de interacções electrostáticas e pontes de hidrogénio. Estes resultados demonstraram que a actividade antiplasmódica dos novos análogos da criptolepina parece ser justificada por efeitos sinérgicos ou aditivos à inibição da formação da hemozoina e citotoxicidade associada à interacção com estruturas de ADN. Com o objectivo de aumentar a diversidade de esqueletos químicos com actividade antimalárica, foram sintetizados novos análogos da indolo[3,2-b]quinolin-11-ona (11-quindolona), tendo como propósito aumentar a retenção destes compostos no interior do vacúolo digestivo do parasita. Para tal, foram introduzidas duas cadeias amino-alquílicas (N,N-dietiletanoamina) no núcleo aromático da quindolona (alquilação em N5 e N10). A reacção originou no entanto padrões de alquilação adicionais, N,O- (94) e O- (95), que foram também avaliados quanto ao seu potencial antiplasmódico e citotoxicidade em células hepáticas HepG2 A16. Com introdução de uma ou duas cadeias aminoalquílicas e átomos de cloro no núcleo aromático, as quindolonas (4, 91a e 91b), inicialmente inactivas, deram origem a compostos com actividade moderada a forte contra a estirpe W2 do P. falciparum resistente à cloroquina, apresentando valores de IC50 entre 51 e 2638 nM, e com maior selectividade para o parasita. Todos os análogos da quindolona sintetizados apresentam também a capacidade de formar complexos com a hematina, com uma estequiometria 1:1 (análogo:FPIX-OH) e constantes de associação (Kass) que variam entre 0,074 e 0,14 x106 M-1. A estabilidade do complexo é assegurada pela formação de interacções π-π entre o núcleo aromático e o anel de porfírina da hematina e estudos de modelação molecular confirmaram a possibilidade de formação de pontes de hidrogénio entre a amina terminal da cadeia lateral e os aniões carboxilato do dimero da hematina. Estes resultados demonstraram que a introdução de cadeias amino-alquílicas no núcleo da quindolona origina compostos com boa actividade antiplasmódica, com aparente capacidade de inibição da formação da hemozoína e possivelmente com maior capacidade de acumulação no vacúolo digestivo do parasita. As indolo[3,2-b]quinolinas demonstraram assim serem bons esqueletos para o desenho e desenvolvimento de compostos para tratamento da malária, obtendo-se compostos mais activos e selectivos para o parasita.Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/29202/2006); Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa, Portugal; Scholl of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Manchester, UK(material and equipment necessary to the development of the study)

New Compound Combining an Integrase-Targeting Aptamer and a Small Interfering RNA Targeting the Trans-Activation Response/Poly A Region of HIV-1 Potently Suppresses HIV-1 Replication

We have developed a novel aptamer-based siRNA delivery system for HIV therapy. Apsi510 was obtained by chemical conjugation of an anti-HIV integrase aptamer and an siRNA sequence targeting the HIV-1 TAR/poly A regions to a dendron [2-((4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)phenyl)amino)acetaldehyde]. Apsi510 activity against HIV-1NL4.3 was evaluated in two experimental systems using HeLa CD4+ and TZM-bl cells. Apsi510 activity was dose-dependent and inhibited >95% of viral replication at 50 nM. Apsi510 inhibited HIV-1 replication to a similar extent as siRNA alone, indicating efficient intracellular release of the siRNA molecule. Apsi510 is a promising drug candidate for the treatment and prevention of HIV

Combining 1,3-ditriazolyl-benzene and quinoline to discover a new G-quadruplex interactive small molecule active against cancer stem-like cells

Quadruplex nucleic acids are promising targets for cancer therapy. In this study we used a fragment-based approach to create new flexible G-quadruplex (G4) DNA-interactive small molecules with good calculated oral drug-like properties, based on quinoline and triazole heterocycles. G4 melting temperature and polymerase chain reaction (PCR)-stop assays showed that two of these compounds are selective G4 ligands, as they were able to induce and stabilize G4s in a dose- and DNA sequence-dependent manner. Molecular docking studies have suggested plausible quadruplex binding to both the Gquartet and groove, with the quinoline module playing the major role. Compounds were screened for cytotoxicity against four cancer cell lines, where 4,4’-(4,4’-(1,3-phenylene)bis(1H1,2,3-triazole-4,1-diyl))bis(1-methylquinolin-1-ium) (1 d) showed the greater activity. Importantly, dose–response curves show that 1 d is cytotoxic in the human colon cancer HT-29 cell line enriched in cancer stem-like cells, a subpopulation of cells implicated in chemoresistance. Overall, this study identified a new small molecule as a promising lead for the development of drugs targeting G4 in cancer stem cells.This work received funding from European Structural & Investment Funds through the COMPETE Program—Programa Operacional de Lisboa under Program grant LISBOA-01-0145-FEDER-016405, and from National Funds through Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) under Program grant SAICTPAC/0019/2015. J.B.V.′s research group was financed by New England Biolabs, Inc. (USA).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Targeting KRAS Oncogene in Colon Cancer Cells with 7-Carboxylate Indolo[3,2-b]quinoline Tri-Alkylamine Derivatives.

A guanine-rich strand within the promoter of the KRAS gene can fold into an intra-molecular G-quadruplex structure (G4), which has an important role in the regulation of KRAS transcription. We have previously identified indolo[3,2-b]quinolines with a 7-carboxylate group and three alkylamine side chains (IQ3A) as effective G4 stabilizers and promising selective anticancer leads. Herein we investigated the anticancer mechanism of action of these compounds, which we hypothesized due to stabilization of the G4 sequence in the KRAS promoter and subsequent down-regulation of gene expression.IQ3A compounds showed greater stabilization of G4 compared to duplex DNA structures and reduced KRAS promoter activity in a dual luciferase reporter assay. Moreover, IQ3A compounds showed high anti-proliferative activity in HCT116 and SW620 colon cancer cells (IC50 < 2.69 μM), without eliciting cell death in non-malignant HEK293T human embryonic kidney, and human colon fibroblasts CCD18co. IQ3A compounds significantly reduced KRAS mRNA and protein steady-state levels at IC50 concentrations, and increased p53 protein steady-state levels and cell death by apoptosis in HCT116 cells (mut KRAS, wt p53). Furthermore, KRAS silencing in HCT116 p53 wild-type (p53(+/+)) and null (p53(-/-)) isogenic cell lines induced a higher level of cell death, and a higher IQ3A-induced cell death in HCT116 p53(+/+) compared to HCT116 p53(-/-).Herein we provide evidence that G4 ligands such as IQ3A compounds can target G4 motifs present in KRAS promoter, down-regulate the expression of the mutant KRAS gene through inhibition of transcription and translation, and induce cell death by apoptosis in colon cancer cell lines. Thus, targeting KRAS at the genomic level with G4 ligands may be a new anticancer therapy strategy for colon cancer

Exposure to IQ3A compounds decreases <i>HSP90</i> and <i>KRAS</i> mRNA, protein expression and <i>KRAS</i> transcription.

<p><b>A.</b> KRAS and HSP90 protein steady-state expression evaluated by immunoblot relative to DMSO (vehicle control), after 72 h exposure to equitoxic (IC₅₀) concentrations of 5-FU, TMPyP4 and IQ3A treatment; <b>B.</b><i>KRAS</i> mRNA steady-state expression was evaluated by Taqman Real-time RT-PCR using specific Taqman Assays for KRAS and β-Actin for normalization. <i>KRAS</i> mRNA steady-state expression levels were calculated by the ΔΔCt method, using DMSO (vehicle control) for calibration; and <b>C.</b> HEK293T cells were co-transfected with pGL3-basic vector (empty vector control), or with <i>KRAS</i> promoter luciferase reporter construct PGL-Ras0.5, or PGL-Ras2.0, together with pRL-TK. Twenty-four hours later, cells were replated in 96-well plates, at 5.000 cells per well. Subsequently, 24 h after replating, cells were exposed to IC₅₀ equitoxic concentration of test compounds IQ3A, TMPyP4 and vehicle (DMSO); <b>D.</b> HCT116, SW620 and HEK293T cells were co-transfected with pGL3-basic vector (empty vector control), or with KRAS promoter luciferase reporter construct PGL-Ras0.5, together with pRL-TK. Twenty-four hours later, cells were replated in 96-well plates, at 5,000 cells per well and exposed to IC₅₀ equitoxic concentration of test compounds IQ3A, TMPyP4 and vehicle (DMSO). <i>KRAS</i> promoter activity levels were evaluated by Dual-Luciferase assay 72 h (<b>C.</b>) or 24 h (<b>D.</b>) after compound exposure. Results are expressed as the luciferase signal ratio of pGL-Ras2.0 or pGL-Ras0.5 to pGL3-basic vector transfected cells, after normalization with Renilla Luciferase. Results are expressed as mean ± SEM of at least three independent experiments; *p < 0.05 and §p < 0.01 from DMSO (vehicle control); and †p <0.05 and ‡p < 0.01 from 5-FU.</p

Structures of studied compounds.

<p>7-carboxylate indolo[3,2-<i>b</i>]quinoline tri-alkylamine derivatives (IQ3A) <b>1a-d</b> and <b>2a-d</b>; G4 ligand porphyrin derivative TMPyP4 and 5-fluorouracil (5-FU) anticancer drug.</p

Exposure to IQ3A compounds increases p53 steady-state protein expression in HCT116 cells.

<p><b>A.</b> p53 protein steady-state expression evaluated by immunoblot relative to DMSO (vehicle control), after 72 h exposure to equitoxic (IC₅₀) concentrations of 5-FU, TMPyP4 and IQ3A. <b>B.</b> Cell populations obtained by Guava ViaCount flow cytometry following 72 h incubation of 5-FU, TMPyP4 and IQ3A at equitoxic (IC₅₀) concentrations, or DMSO (vehicle control), in HCT116 p53 (+/+) and p53 (−/−) isogenic cell lines transfected with 40 nM siRNA KRAS or siRNA control. Results are expressed as mean ± SEM of at least three independent experiments. <b>A.</b> §p < 0.01 from DMSO (vehicle control); and ‡p < 0.01 from 5-FU. <b>B.</b> *p < 0.05 from siRNA control in P53 (+/+) cells; §p < 0.05 from siRNA control in p53 (-/-) cells; and †p <0.05 from siRNA KRAS in p53 (-/-) cells.</p