Novel C11 amino derivatives of cryptolepine : synthesis and in vitro studies with DNA and haeme

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010Malaria is one of the most widespread infectious diseases of our time. The global malaria map has been shrinking over the past 60 years, but today more people are at risk of suffering from malaria than any other time in history. In the past few years malaria has once again attracted more attention, partly because it is recognized that malaria spread in sub-Saharan Africa has increased in the recent years, mainly due to the development of drug resistances. Cryptolepine (1), is an indoloquinoline alkaloid, extracted from the West African climbing shrub Cryptolepis sanguinolenta (Lindl.) Schltr, a traditional herb used in folk medicine for the treatment of malaria. Several authors hypothesized that the mechanism of action of cryptolepine could be by inhibition of haemozoin formation in the digestive vacuole (DV) of the parasite, however in a microscopic fluorescence study, the indoloquinoline chromophore, was suggested to accumulate into specific parasite structures that could correspond to the parasite nuclei, and thus justifying its activity due to cytotoxic effects on DNA and topoisomerase II activity. Cryptolepine derivatives (3) have been synthesized through the incorporation of basic side-chains in the C-11 position of the 10H-indolo[3,2-b]quinoline scaffold and evaluated for their antiplasmodial and cytotoxicity properties. The derivative containing a conformationally restricted piperidine sidechain (3n) presented IC50 values of 23-44 nM against chloroquine resistant strains and a selectivity index value of ca 1400, i.e. a 1000-fold improvement in selectivity when compared with 1. The introduced side chains are weakly basic, with pKa values in the terminal amine functionality ranging from 5.2 to 12.5, and are predicted to promote accumulation inside the DV to an extent similar to that of chloroquine. All compounds within this series showed the ability to interact with monomeric haematin (FPIX-OH), with a stoichiometry of 1:1 (3:FPIX-OH) and with association constants (Kass) values between 0.062 and 0.41 x106 M-1, comparable to chloroquine (Kass = 0.085 x106 M-1). The complex stabilization is assured by π-π stacking interactions modulated by the aromatic core, and H-bond between the terminal amine side chain and haematin carboxylate anions, thus capable to inhibit haemozoin formation in DV. However, localization studies of compound 3n inside parasite blood stages suggest an additional mechanism of action, like interactions with DNA, besides inhibition of haemozoin crystal growth. Cryptolepine derivatives (3) bind strongly to double-stranded d(GATCCTAGGATC)2 oligonucleotide with association constants ranging from 105 M-1 to 107 M-1. Furthermore, molecular docking simulations showed that, in contrast with 1, compounds 3 are predicted to not intercalate into DNA double helix, binding essentially to single- and double-stranded DNA, with a stoichiometry of 2:1 (3:DNA), through electrostatic and H-bonding interaction involving charged nitrogens. In order to explore the indolo[3,2-b]quinolin-11-one (quindolone) scaffold (4), and get new antimalarial chemotypes, we decided to synthesize a series of quindolones derivatives (5), targeting malaria parasite digestive vacuole and haeme detoxification pathway, through the introduction of N,N diethylethanamine in the indolo[3,2-b]quinoline aromatic nucleus (N5,N10-alkylation). This reaction gave N,O- (94), N,N- (5) and O-(95) alkylated products containing two or one basic side-chains, which were evaluated for antiplasmodial activity against chloroquine-resistant P. falciparum W2 strain and cytotoxicity for HepG2 A16 hepatic cells. By incorporating alkylamine side chains and chlorine atoms in the quindolone nucleus we transformed the inactive tetracyclic parent quindolones (4, 91a and 91b) into moderate or highly active and selective compounds to the resistant P. falciparum W2 strain, with IC50 ranging from 51 to 2638 nM and with selectivity ratios up to 98. All the quindolone derivatives in the series showed the ability to complex FPIX-OH (1:1 stoichiometry) with associations constants (Kass) ranging from 0,074 to 0,14 x106 M-1, being the main intermolecular interactions due to π-π stacking interactions and H-bond between derivatives and haematin. Cryptolepine and the new antimalarial chemotype, quindolone, are suitable scaffolds for the design of active and selective compounds targeting parasite haemozoin detoxification pathway, with potential for development as antimalarial agents.A malária ou paludismo é uma doença infecciosa provocada por parasitas do género Plasmodium e transmitida pela picada do mosquito fêmea do género Anopheles. A malária é uma das infecções mais difundida por todo o mundo. Apesar propagação ter diminuído nos últimos 50 anos, nos dias de hoje há mais pessoas em risco de contaminação com malária do que em qualquer outra época da história. Em 2008, a malária era endémica em 108 países, contando com cerca de 247 milhões de casos reportados, 3,3 mil milhões de pessoas em risco. Anualmente, entre 1 a 3 milhões de casos culminam em morte, dos quais, muitos são crianças com idade inferior a 5 anos. A malária é a principal causa de morte infantil em África, sendo que 60 % dos novos casos registados todos os anos ocorrem na África sub-Sahariana, onde ocorrem 90 % dos casos fatais de malária. Para além de ser um grave problema de saúde pública, a malária é também um problema sócio-económico, não só devido ao elevado investimento efectuado na prevenção e tratamento, mas também devido a custos indirectos resultantes da perda de productividade que advêm da elevada morbilidade e mortalidade. No entanto, recentemente a malária voltou a chamar a atenção da comunidade, muito porque foi reconhecido que o número de casos reportados em África tem aumentado nos últimos anos devido ao aumento de fenómenos de resistência nos parasitas aos fármacos utilizados para tratamento da infecção. Apesar da enorme variedade de compostos com actividade antimalárica, a sua eficácia contínua no entanto a ser reduzida devido aos fenómenos de resistência associados. A cloroquina (2) é uma 4- amionoquinolina sintetizada em 1934 e tem sido um dos pilares do tratamento da malária nos últimos 60 anos, sendo de consenso geral, que a sua actividade antimalárica se deva à inibição da formação do cristal de hemozoína no vacúolo digestivo do parasita. No organismo humano, o parasita ingere hemoglobina e digere-a, libertando os amino ácidos necessários para o seu desenvolvimento, e o heme, tóxico para o parasita. Este heme é então biocristalizado pelo parasita a hemozoina, um cristal inerte e não tóxico. A cloroquina, devido às suas propriedades básicas, apresenta a capacidade de se acumular no interior do vacúolo digestivo acídico e formar complexos estáveis cloroquina:heme, através de interacções π-π entre os anéis aromáticos, impedindo assim a formação da hemozoina e originando a morte do parasita. Vários autores referem ainda que a cloroquina apresenta também a capacidade de complexar com as faces em crescimento do cristal de hemozoina, inibindo assim o processo de cristalização. Nos últimos 30 anos, extractos de uma enorme variedade de espécies de plantas, incluindo muitas utilizadas na medicinal tradicional, têm sido avaliadas in vitro quanto à sua actividade antimalárica. O alcalóide criptolepina (1), constituinte maioritário da raíz da Cryptolepis sanguinolenta, um arbusto trepador africano normalmente utilizado na medicina tradicional para tratamento da malária, demonstrou possuir propriedades antiplasmodicas equivalentes à cloroquina. A criptolepina parece exercer as propriedades antiplasmodicas devido à capacidade de inibir a formação da hemozoina, tal como a cloroquina, ligando-se ao heme e bloqueando assim o mecanismo de destoxificação do parasita. No entanto, a criptolepina é também um agente intercalante de cadeias de ADN ricas em guanina (G) e citosina (C), e tendo preferência por sequências CC não alternadas. Assim, a criptolepina apresenta propriedades citotóxicas devido à inibição da topoisomerase II e da síntese do ADN. Estas propriedades citotóxicas podem também estar na origem da actividade antiplasmódica uma vez que, um estudo de localização intracelular em eritrócitos infectados com P. falciparum, revelou que o alcalóide se acumula em estruturas no interior do parasita que poderão corresponder ao núcleo. Neste trabalho foram sintetizados 25 análogos da criptolepina (3) com cadeias laterais diaminoalquílicas, na posição C11 do núcleo aromático da indolo[3,2-b]quinolina e avaliados quanto as suas propriedades antiplasmodicas e citotóxicas em linhas celulares de mamífero. O análogo com uma cadeia lateral de piperidina (3n), apresentou uma actividade antiplasmódica (IC50) variando entre 23 e 44 nM, contra diferentes estripes resistentes à cloroquina, e um índice de selectividade de aproximadamente 1400, representando um aumento de cerca de 1000 vezes quando comparado com 1. Os nossos estudos sugerem que a introdução de cadeias laterais com aminas terminais basicas, apresentando valores de pKa variando entre 5,2 e 12,5, promove a acumulação dos compostos no interior do vacúolo digestivo do parasita, em níveis de concentração semelhantes aos da cloroquina. Todos os análogos da criptolepina sintetizados apresentam a capacidade de formar complexos com o monómero da hematina (FPIX-OH), com constantes de associação (Kass) variando entre 0,062 e 0,41 x106 M-1, semelhante à constante de associação determinada para a cloroquina (Kass = 0,085 x106 M-1). Os complexos são estabilizados maioritariamente através de interacções π-π entre o núcleo aromático da indolo[3,2-b]quinolina e o núcleo porfirínico da hematina. Estudos de modelação molecular revelaram também que os azotos protonados nas aminas terminais das cadeias laterais podem formar pontes de hidrogénio com os iões carboxilato da hematina. Estes resultados demonstraram que os novos análogos da criptolepina apresentam a capacidade de complexar com a FPIX-OH e inibir a formação da hemozoina. No entanto, o estudo de localização intracelular realizado por microscopia de fluorescência em eritrócitos infectados com P. falciparum, demonstrou que os análogos da criptolepina também apresentam a capacidade de se acumularem no núcleo do parasita e assim, potenciar a actividade antiplasmódica. De modo a avaliar a capacidade de 3 para interagir com estruturas de ADN, foram realizados estudos de interacção com um oligonucleótido de cadeia única d(5’-GCCAAACACAGAATCG-3’) e de cadeia dupla d(GATCCTAGGATC)2. Os compostos 3 apresentaram forte capacidade de complexação com ambas as estruturas de DNA e valores de constante de associação (Kass) variando entre 105 M-1 e 107 M-1. Estudos de modelação molecular com estruturas de ADN de hélice duplas semelhante à utilizada no ensaios in vitro, demonstraram que os compostos não são agentes intercalantes, tal como verificado para a criptolepina, mas ligam-se à fenda menor/maior, com uma estequiometria 2:1 (análogo da criptolepina:ADN) e interagem preferencialmente com a cadeia de fosfatos através de interacções electrostáticas e pontes de hidrogénio. Estes resultados demonstraram que a actividade antiplasmódica dos novos análogos da criptolepina parece ser justificada por efeitos sinérgicos ou aditivos à inibição da formação da hemozoina e citotoxicidade associada à interacção com estruturas de ADN. Com o objectivo de aumentar a diversidade de esqueletos químicos com actividade antimalárica, foram sintetizados novos análogos da indolo[3,2-b]quinolin-11-ona (11-quindolona), tendo como propósito aumentar a retenção destes compostos no interior do vacúolo digestivo do parasita. Para tal, foram introduzidas duas cadeias amino-alquílicas (N,N-dietiletanoamina) no núcleo aromático da quindolona (alquilação em N5 e N10). A reacção originou no entanto padrões de alquilação adicionais, N,O- (94) e O- (95), que foram também avaliados quanto ao seu potencial antiplasmódico e citotoxicidade em células hepáticas HepG2 A16. Com introdução de uma ou duas cadeias aminoalquílicas e átomos de cloro no núcleo aromático, as quindolonas (4, 91a e 91b), inicialmente inactivas, deram origem a compostos com actividade moderada a forte contra a estirpe W2 do P. falciparum resistente à cloroquina, apresentando valores de IC50 entre 51 e 2638 nM, e com maior selectividade para o parasita. Todos os análogos da quindolona sintetizados apresentam também a capacidade de formar complexos com a hematina, com uma estequiometria 1:1 (análogo:FPIX-OH) e constantes de associação (Kass) que variam entre 0,074 e 0,14 x106 M-1. A estabilidade do complexo é assegurada pela formação de interacções π-π entre o núcleo aromático e o anel de porfírina da hematina e estudos de modelação molecular confirmaram a possibilidade de formação de pontes de hidrogénio entre a amina terminal da cadeia lateral e os aniões carboxilato do dimero da hematina. Estes resultados demonstraram que a introdução de cadeias amino-alquílicas no núcleo da quindolona origina compostos com boa actividade antiplasmódica, com aparente capacidade de inibição da formação da hemozoína e possivelmente com maior capacidade de acumulação no vacúolo digestivo do parasita. As indolo[3,2-b]quinolinas demonstraram assim serem bons esqueletos para o desenho e desenvolvimento de compostos para tratamento da malária, obtendo-se compostos mais activos e selectivos para o parasita.Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/29202/2006); Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa, Portugal; Scholl of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Manchester, UK(material and equipment necessary to the development of the study)

Pop Pop Poesia: ácido de A a Z experimentação em poesia das novas mídias

Projeto experimental em Poesia das Novas Mídias composto do livro Pop Pop Poesia – ácido de A a Z e do enhanced CD Pop Pop Poesia – ácido de A a Z Versão redonda. Explora a nova linguagem artística surgida com o advento dos avanços tecnológicos e meios digitais, e as possibilidades de comunicação trazidas pelo computador. A união do áudio e do vídeo à palavra poética e a transformação do leitor em operador da mensagem – que é chamado a abandonar a antiga passividade perante a obra literária - são as suas principais características. A partir do estudo dos movimentos de Vanguardas das literaturas européia e americana e seus reflexos e desdobramentos no Brasil, é traçado o panorama histórico da poesia do século XX ao XXI. Essa análise serve para pontuar o trabalho, revelando as influências do texto e das formas escolhidas

Method for monitoring intertidal communities in a steep rocky shore: a combination of digital image technology and field operational strategy

Este trabalho apresenta uma metodologia para estudos temporais de comunidades entre-marés de costões rochosos com acentuada inclinação, associando tecnologia de captura de imagens digitais com uma estrutura operacional de campo, permitindo a amostragem de ampla faixa da comunidade, em pouco tempo. Dois métodos tradicionais de estimativa de porcentagem de cobertura (estimativa visual e pontos de interseção) foram usados para comparar a aplicabilidade do método proposto a um estudo de sucessão, quanto às vantagens econômicas, operacionais e qualidade dos dados obtidos. O método permite a amostragem temporal de múltiplos transectos verticais específicos, por meio de fotos seqüenciais. As mesmas são fundamentais para a posterior montagem da imagem do transecto num programa de edição de imagem através da compilação das fotos e sobreposição temporal dos transectos. Este método obteve resultados similares ao método de pontos de interseção quanto às leituras de porcentagem de cobertura, além de reduzido tempo em campo, vantagens econômicas e vantagens do uso das fotografias digitais. A análise das transições temporais permitiu a obtenção de parâmetros como recrutamento, mortalidade e crescimento populacional, além da montagem de uma animação com a sucessão. Consideramos esta metodologia a mais indicada para estudos de sucessão ecológica, especialmente no monitoramento de comunidades de invertebrados bentônicos do médiolitoral, em costões de inclinação acentuada.This paper introduces a method for temporal studies of steep rocky intertidal communities. It combines the use of digital image technology with field methodology, so that a wide area of the community can be sampled in a short time. Two current nondestructive percent cover estimation methods (visual estimation and point intersection) were compared in terms of cost, operational advantages and data quality, with a proposed method for a sucessional study . The proposed method used sequential photos to sample multiple fixed vertical transects over time. Reproduction of the mid-intertidal transect over time was possible by overlaying temporal transects in an image editing program. This method was similar to the point intersection quadrat method used to estimate percent cover. Benefits included reduced time on field work, economic advantages and other advantages of using digital photography, such as recording. Temporal photography of transects provided measurements of recruitment, mortality and population growth, and made it possible to manufacture an animation of sucessional stages. We suggest that this is the best method for providing information and understanding on the process of succession and for monitoring benthic invertebrate intertidal communities on steep rocky shores

Pedagogia da Práxis e as tecnologias: um caminho para o ensino da Física

Este artigo apresenta reflexões sobre uma proposta de ensino de Física, sob o conceito de educação para cidadania, mediada por tecnologias, em especial vídeos e animações. Para tal, nos apoiamos na legislação que rege o ensino no Brasil e suas orientações; na pedagogia da Práxis de Gadotti (2004-2006); e nas experiências de ensino e aprendizagem inovadores com tecnologias (MORAN, 2000). Como sustentação da proposta, foram elaboradas aulas na perspectiva da práxis pedagógica, com utilização de vídeos e animações. Trabalhamos com alunos da 1ª série de uma escola estadual de ensino médio, localizada no Rio de Janeiro. A proposta propiciou um diálogo entre a experiência prática e a construção do conhecimento

METABOLISMO NITROGENADO DO BIVALVE ANTÁRTICO LATERNULA ELLIPTICA (KING & BRODERIP) E O SEU USO POTENCIAL COMO BIOMARCADOR.

The Antarctic marine environment is characterized by the extreme seasonality of the primary production in the water column and the low but stable temperatures. Both are considered the main factors in the adaptative evolution of Antarctic ectothermic organisms. Studies about physiological and biochemical processes of the cold-adapted species revealed the presence of antifreeze glycoproteins in the biological fluids and cold-adapted proteins. The low and stable temperatures have resulted in the appearence of enzymes with high catalytic efficiency and the absence of the thermal stress proteins in some Antarctic fishes. The austral winter promotes a seasonal food shortage, submitting the benthic ectotherms to long periods of starvation. This is particularly true for the organisms that depend on phytoplankton as their primary source of food. The Antarctic marine environment also presents areas of high copper concentrations on the sediment surface as well as cadmium in the water column. The bivalve Laternula elliptica, a circumpolar species, has been proposed as bioindicator for long term monitoring of heavy metals in the shallow waters of Antarctica due to its capacity to accumulate metals, especially cadmium and zinc. Like other Antarctic ectothermic organisms, L. elliptica changes its metabolism from aerobic to anaerobic as a function of temperature, being 6 ºC critical and 9 ºC lethal. This bivalve also shows a marked seasonality in its metabolism, with low oxygen consumption in winter as compared to summer. It is speculated that it enters into a dormancy state during the austral winter as it apparently retracts its siphons below the sediment surface. The apparent supression of the water pumping by the siphons during winter forces L. elliptica to mobilize its energy reserves, using the siphon proteins as its principal source of energy (ratio of oxygen consumption/excreted nitrogen = 3.0). Even during summer, when the high food supply stimulates the bivalve growth, the metabolism is mainly protein based. (O:N ratio = 16). The excretory nitrogen metabolism of this bivalve is typically ammoniotelic, characterized by the excretion of almost 90% of nitrogen in the form of ammonia and 10% as urea. Probably, the urea excreted arises from the hydrolysis of the proteic aminoacid L-arginine by arginase in order to maintain the tissue levels of that aminoacid. In such case, the presence of this enzyme in the kidney tissues may be related to the physiological constraints caused by the retraction of the siphons and the requirements for the excretion of this nitrogen compound during the austral winter. Studies with the renal arginase of this bivalve showed a high metabolic tolerance to the metallic cations Cu, Zn, Fe and Cd, when compared to the arginase behavior of other bivalves such as Dreissena polymorpha. The present work covers the life history of this bivalve, its potential use as a biomarker and its adaptations to the extreme marine environment conditions in Antarctica.O ambiente marinho Antártico é caracterizado pela extrema sazonalidade da produção primária na coluna d´água e por temperaturas baixas e estáveis. Esses dois fatores têm sido tratados como os principais responsáveis pela evolução adaptativa dos organismos ectotérmicos Antárticos. Os estudos sobre a presença de mecanismos bioquímicos e isiológicos de adaptação às baixas temperaturas revelaram a existência de glicoproteínas anticongelantes nos fluídos biológicos e de proteínas adaptadas ao frio. Enzimas com elevada eficiência catalítica e a ausência de proteínas de estresse térmico em algumas espécies de peixes Antárticos revelam, em parte, algumas das adaptações experimentadas por esses organismos ao longo do processo evolutivo, sob a pressão seletiva das temperaturas baixas e estáveis. A sazonalidade alimentar, imposta pelo inverno austral, proporciona um longo período de restrição alimentar para os ectotérmicos bentônicos, especialmente para os filtradores de fitoplâncton, que dependem diretamente da produção primária como fonte de alimento. O ambiente marinho Antártico também apresenta regiões com elevada concentração de cobre na superfície do sedimento e de cádmio na coluna d´água. O bivalve infaunal Laternula elliptica apresenta distribuição circumpolar e tem sido postulado como um bioindicador para o monitoramento, a longo prazo, de metais pesados nas águas rasas do ambiente marinho Antártico, em função da sua capacidade de bioacumular alguns metais, em especial cádmio e zinco. Semelhante a outros organismos ectótermicos Antárticos, L. elliptica altera o seu perfil metabólico de aeróbio para anaeróbio, em função do aumento da temperatura ambiente, estabelecida em 6 ºC, como crítica e a 9 ºC, como letal. Esse bivalve também apresenta uma acentuada sazonalidade metabólica, marcada pelo baixo consumo de oxigênio, no inverno, em relação ao verão, o qual é acompanhado pela aparente retração do sifão para uma posição abaixo da linha do sedimento, levando a especulação sobre um possível estado de dormência ao longo do inverno austral. A aparente supressão do bombeamento de água pelos sifões, durante o inverno, leva L. elliptica a mobilizar as suas reservas energéticas e utilizar proteínas do sifão como o seu principal combustível energético (razão oxigênio consumido/nitrogênio excretado = 3,0). Mesmo durante o verão, quando a oferta alimentar acelera o crescimento desse bivalve, o metabolismo da L. elliptica continua sendo principalmente protéico (razão O:N = 16). O metabolismo nitrogenado excretório desse bivalve é tipicamente amoniotélico, caracterizado pela excreção de 90% do nitrogênio na forma de amônia e 10% como uréia. Provavelmente, a uréia excretada é decorrente da hidrólise do aminoácido protéico L-arginina, como forma de manutenção dos níveis teciduais desse aminoácido, em reação catalisada pela arginase. Neste caso, a presença dessa enzima no tecido renal da L. elliptica pode estar relacionada com as limitações impostas pela retração do sifão durante o inverno austral e as necessidades fisiológicas excretoras desse composto nitrogenado. Estudos com a arginase renal da L. elliptica também revelaram a sua maior resistência à inibição pelos cátions metálicos Cu, Zn, Fe e Cd, quando comparado ao comportamento da arginase de outros bivalves, como por exemplo, Dreissena polymorpha. Assim, a presente revisão reúne informações sobre a história de vida desse bivalve, seu potencial biomarcador e a sua evolução adaptativa nas condições extremas do ambiente marinho Antártico

Combining 1,3-Ditriazolylbenzene and Quinoline to Discover a New G-Quadruplex-Interactive Small Molecule Active against Cancer Stem-Like Cells

Quadruplex nucleic acids are promising targets for cancer therapy. In this study we used a fragment‐based approach to create new flexible G‐quadruplex (G4) DNA‐interactive small molecules with good calculated oral drug‐like properties, based on quinoline and triazole heterocycles. G4 melting temperature and polymerase chain reaction (PCR)‐stop assays showed that two of these compounds are selective G4 ligands, as they were able to induce and stabilize G4s in a dose‐ and DNA sequence‐dependent manner. Molecular docking studies have suggested plausible quadruplex binding to both the G‐quartet and groove, with the quinoline module playing the major role. Compounds were screened for cytotoxicity against four cancer cell lines, where 4,4′‐(4,4′‐(1,3‐phenylene)bis(1H‐1,2,3‐triazole‐4,1‐diyl))bis(1‐methylquinolin‐1‐ium) (1 d) showed the greater activity. Importantly, dose–response curves show that 1 d is cytotoxic in the human colon cancer HT‐29 cell line enriched in cancer stem‐like cells, a subpopulation of cells implicated in chemoresistance. Overall, this study identified a new small molecule as a promising lead for the development of drugs targeting G4 in cancer stem cells