Phosphorylation via PKC Regulates the Function of the Drosophila Odorant Co-Receptor

Insect odorant receptors (ORs) have a unique design of heterodimers formed by an olfactory receptor protein and the ion channel Orco. Heterologously expressed insect ORs are activated via an ionotropic and a metabotropic pathway that leads to cAMP production and activates the Orco channel. The contribution of metabotropic signaling to the insect odor response remains to be elucidated. Disruption of the Gq protein signaling cascade reduces the odor response (Kain et al., 2008). We investigated this phenomenon in HEK293 cells expressing Drosophila Orco and found that phospholipase C (PLC) inhibition reduced the sensitivity of Orco to cAMP. A similar effect was seen upon inhibition of protein kinase C (PKC), whereas PKC stimulation activated Orco even in the absence of cAMP. Mutation of the five PKC phosphorylation sites in Orco almost completely eliminated sensitivity to cAMP. To test the impact of PKC activity in vivo we combined single sensillum electrophysiological recordings with microinjection of agents affecting PLC and PKC function and observed an altered response of olfactory sensory neurons (OSNs) to odorant stimulation. Injection of the PLC inhibitor U73122 or the PKC inhibitor Gö6976 into sensilla reduced the OSN response to odor pulses. Conversely, injection of the PKC activators OAG, a diacylglycerol analog, or phorbol myristate acetate (PMA) enhanced the odor response. We conclude that metabotropic pathways affecting the phosphorylation state of Orco regulate OR function and thereby shape the OSN odor response

Robust and scalable barcoding for massively parallel long‑read sequencing

Nucleic-acid barcoding is an enabling technique for many applications, but its use remains limited in emerging long-read sequencing technologies with intrinsically low raw accuracy. Here, we apply so-called NS-watermark barcodes, whose error correction capability was previously validated in silico, in a proof of concept where we synthesize 3840 NS-watermark barcodes and use them to asymmetrically tag and simultaneously sequence amplicons from two evolutionarily distant species (namely Bordetella pertussis and Drosophila mojavensis) on the ONT MinION platform. To our knowledge, this is the largest number of distinct, non-random tags ever sequenced in parallel and the frst report of microarray-based synthesis as a source for large oligonucleotide pools for barcoding. We recovered the identity of more than 86% of the barcodes, with a crosstalk rate of 0.17% (i.e., one misassignment every 584 reads). This falls in the range of the index hopping rate of established, highaccuracy Illumina sequencing, despite the increased number of tags and the relatively low accuracy of both microarray-based synthesis and long-read sequencing. The robustness of NS-watermark barcodes, together with their scalable design and compatibility with low-cost massive synthesis, makes them promising for present and future sequencing applications requiring massive labeling, such as long-read single-cell RNA-Seq.Fil: Ezpeleta, Joaquín. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas; Argentina.Fil: Labari, Ignacio Garcia. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas; Argentina.Fil: Bulacio, Pilar. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas; Argentina.Fil: Tapia, Elizabeth. Centro Internacional Franco Argentino de Ciencias de la Información y de Sistemas; Argentina.Fil: Ezpeleta, Joaquín. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura; Argentina.Fil: Bulacio, Pilar. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura; Argentina.Fil: Tapia, Elizabeth. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Exactas, Ingeniería y Agrimensura; Argentina.Fil: Villanova, Gabriela Vanina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Lavista Llanos, Sofía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Villanova, Gabriela Vanina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio Mixto de Biotecnología Acuática. Centro Científico Tecnológico y Educativo Acuario del Río Paraná; Argentina.Fil: Posner, Victoria María. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio Mixto de Biotecnología Acuática. Centro Científico Tecnológico y Educativo Acuario del Río Paraná; Argentina.Fil: Arranz, Silvia Eda. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio Mixto de Biotecnología Acuática. Centro Científico Tecnológico y Educativo Acuario del Río Paraná; Argentina.Fil: Krsticevic, Flavia. The Hebrew University of Jerusalem. Robert H Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment; Israel

Estudio de funciones inmunológicas de Astrocitos, en cultivo

La producción de NO' junto a otras funciones inmunológicas de las células de la glía está implicada en la patofisiología del SNC. En la primera parte de este Seminario se estudió la producción de NO' por astrocitos de cerebro en cultivo, y su regulación por los glucocorticoides. Los resultados corroboran la presencia de las enzimas NOS constitutiva e inducible G‘IOScy NOSi) en astrocitos, siendo la fagocitosis un estímulo capaz de inducir la producción de NO“.Los glucocorticoides tuvieron un efecto dual, incrementando la producción constitutiva de NO‘ y disminuyendo la inducida por fagocitosis. A su vez, el efecto inhibitorio de la Dex sobre la producción de NO‘ se correlacionó con una disminución de la fagocitosis. Los resultados obtenidos en el primer Capítulo muestran algunas delas funciones inmunológicas que aparentemente los astrocitos de cerebro cumplen en el SNC. Esta experiencia nos sirvió para encarar el estudio de astrocitos provenientes de la médula espinal de ratones Wobbler, modelo animal de la Esclerosis Lateral Amiotrófica considerada por algunos de origen autoinmune, que tiene la característica de presentar degeneración en las motoneuronas y una pronunciada astrocitosis en la médula espinal. De acuerdo a ello, en el segundo Capítulo se presentan los resultados obtenidos con cultivos de astrocitos provenientes de la médula de esto animales. En todos los casos estudiados la proliferación de las células wr/wr resultó menor que la de sus controles (wr/+), y mientras que en estos últimos la IL-l y la corticosterona (Cort ) aumentaron la proliferación, solamente el TGF-Bl fue activo en wr/wr y no en controles. La inactividad mitogénica de Cort in vitro no se correspondió con la presencia de receptores para glucocorticoides (GR) en astrocitos wr/wr, los que resultaron fimcionales en la regulación de la proteína GFAP. Por otra parte, se estudiaron la expresión de la proteína GFAP y el área astrocitaria, resultando ambas aumentadas en los astrocitos wr/wr. Los resultados obtenidos muestran, en los cultivos de astrocitos provenientes de ratones Wobbler (wr/wr), anormalidades morfológicas, disminución de proliferación basal e insensibilidad a los agentes proliferativos usuales, con respuesta anormal al TGF-Bl. Esto sugiere una importante patología astrocitaria en la médula espinal del modelo murino de ELA.Fil: Lavista Llanos, Sofía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Transcriptional response to hypoxia in Drosophila melanogaster, controlled by the bHLH-PAS proteins: Similar y Tango

En mamíferos, se ha demostrado que el factor de transcripción hetero-dimérico bHLH-PAS - Hypoxia Inducible Factor (HIF) - es un regulador clave de la respuesta a hipoxia induciendo la expresión de genes regulada por oxígeno. En esta tesis demostramos la existencia de un sistema homólogo en Drosophila, y caracterizams su actividad in vivo durante el desarrollo. Usando reporteros transcripcionales en moscas transgénicas mostramos que la actividad trancripcional inducible por hipoxia aumenta a lo largo del desarrollo resultando máxima hacia el final de la embriogénesis. Mostramos que los diferentes tipos celulares tienen distintos niveles de sensibilidad a hipoxia y que las células traqueales son más sensibles respondiendo a hipoxia suaves. Mostramos que las proteínas bHLH-PAS Similiar (Sima) y Tango funcionan como los homólogos de HIF-α y β respectivamente, y demostramos un modo conservado de regulación por oxígeno para Sima. La proteína Sima se indujo en hipoxia, mientras el nivel de su ARN mensajero no varió con la concentración de oxígeno. En experimentos de un pulso de expresión ectópica de Sima seguidos de una curva de tiempo vimos que Sima se estabiliza en hipoxia y que su degradación depende de oxígeno. La expresión ectópica continua de Sima superó su tasa de degradación permitiéndonos estudiar el control de su localización subcelular. Sima es mayormente citoplasmática en normoxia y la proteína transloca al núcleo únicamente en hipoxia, revelando una segunda etapa de activación regulada por oxígeno. Describimos que la localización subcelular de Sima se encuentra modulada por parámetros del desarrollo. Caracterizamos el mecanismo que gobierna la localización subcelular dependiente de oxígeno de Sima. Mostramos que Sima entra y sale continuamente del núcleo al citoplasma y caracterizamos la exportación nuclear de Sima, cuyo mecanismo involucra al receptor de exportación nuclear CRM-1/Embargoed y es dependiente de oxígeno. Mostramos que el factor supresor de tumores deVon Hippel Lindau (VHL) modula la exportación nuclear de Sima, la cual requiere la hidroxilación de un residuo de prolina específico (Pro850). Proponemos que la localización núcleo-citoplasmática de HIFα/Sima resulta de un quilibrio dinámico entre la importación y la exportación nuclear, siendo este último un proceso modulado por oxígeno.In mammalian systems, the heterodimeric bHLH-PAS transcription factor - Hypoxia Inducible Factor (HIF) - has emerged as the key regulator of responses to hipoxia. In this thesis we defined a homologous system in Drosophila, and characterise its activity in vivo during development flies we show that hypoxia inducible activity rises to peak levels in late embryogenesis, and is most pronounced in tracheal cells. We show that the bHLH-PAS protein Similar (Sima) and Tango function as HIF-α and β homologues respectively, and demonstrate a conserved mode of regulation for Sima by oxygen. Sima protein, but not its mRNA, was upregulated in hypoxia. Time course experiments following pulsed ectopic expression demonstrated that Sima is degraded in normoxia. Continuous ectopic expression over-rode Sima degradation which remained cytoplasmic in normoxia, and translocated to the nucleus only in hypoxia, revealing a second oxygen regulated activation step. We also show that Sima shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm. We characterized nuclear export of Sima which occurs through a mechanism that involves the nuclear export receptor CRM1/Embargoed and is oxygen-dependent. The Von Hippel Lindau (VHL) tumor suppressor factor modulates nuclear export of Sima, which requires hydroxylation of a specific prolyl residue (Pro850). We propose that HIFα/Sima nucleo-cytoplasmic localization is the result of a dynamic equilibrium between nuclear import and nuclear export, being the latter process modulated by oxygen tension.Fil:Lavista Llanos, Sofía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Control of the Hypoxic Response in Drosophila melanogaster by the Basic Helix-Loop-Helix PAS Protein Similar

In mammalian systems, the heterodimeric basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS transcription hypoxia-inducible factor (HIF) has emerged as the key regulator of responses to hypoxia. Here we define a homologous system in Drosophila melanogaster, and we characterize its activity in vivo during development. By using transcriptional reporters in developing transgenic flies, we show that hypoxia-inducible activity rises to a peak in late embryogenesis and is most pronounced in tracheal cells. We show that the bHLH-PAS proteins Similar (Sima) and Tango (Tgo) function as HIF-α and HIF-β homologues, respectively, and demonstrate a conserved mode of regulation for Sima by oxygen. Sima protein, but not its mRNA, was upregulated in hypoxia. Time course experiments following pulsed ectopic expression demonstrated that Sima is stabilized in hypoxia and that degradation relies on a central domain encompassing amino acids 692 to 863. Continuous ectopic expression overrode Sima degradation, which remained cytoplasmic in normoxia, and translocated to the nucleus only in hypoxia, revealing a second oxygen-regulated activation step. Abrogation of the Drosophila Egl-9 prolyl hydroxylase homologue, CG1114, caused both stabilization and nuclear localization of Sima, indicating a central involvement in both processes. Tight conservation of the HIF/prolyl hydroxylase system in Drosophila provides a new focus for understanding oxygen homeostasis in intact multicellular organisms

Central Role of the Oxygen-dependent Degradation Domain of Drosophila HIFα/Sima in Oxygen-dependent Nuclear Export

The Drosophila HIFα homologue, Sima, is localized mainly in the cytoplasm in normoxia and accumulates in the nucleus upon hypoxic exposure. We have characterized the mechanism governing Sima oxygen-dependent subcellular localization and found that Sima shuttles continuously between the nucleus and the cytoplasm. We have previously shown that nuclear import depends on an atypical bipartite nuclear localization signal mapping next to the C-terminus of the protein. We show here that nuclear export is mediated in part by a CRM1-dependent nuclear export signal localized in the oxygen-dependent degradation domain (ODDD). CRM1-dependent nuclear export requires both oxygen-dependent hydroxylation of a specific prolyl residue (Pro850) in the ODDD, and the activity of the von Hippel Lindau tumor suppressor factor. At high oxygen tension rapid nuclear export of Sima occurs, whereas in hypoxia, Sima nuclear export is largely inhibited. HIFα/Sima nucleo-cytoplasmic localization is the result of a dynamic equilibrium between nuclear import and nuclear export, and nuclear export is modulated by oxygen tension