Biochemical and structural characterisation of membrane-containing icosahedral dsDNA bacteriophages infecting thermophilic Thermus thermophilus

AbstractIcosahedral dsDNA viruses isolated from hot springs and proposed to belong to the Tectiviridae family infect the Gram-negative thermophilic Thermus thermophilus bacterium. Seven such viruses were obtained from the Promega Corporation collection. The structural protein patterns of three of these viruses, growing to a high titer, appeared very similar but not identical. The most stable virus, P23-77, was chosen for more detailed studies. Analysis of highly purified P23-77 by thin layer chromatography for neutral lipids showed lipid association with the virion. Cryo-EM based three-dimensional image reconstruction of P23-77 to 1.4 nm resolution revealed an icosahedrally-ordered protein coat, with spikes on the vertices, and an internal membrane. The capsid architecture of P23-77 is most similar to that of the archaeal virus SH1. These findings further complicate the grouping of icosahedrally-symmetric viruses containing an inner membrane. We propose a single superfamily or order with members in several viral families

Molecular Mechanisms of Membrane Deformation by I-BAR Domain Proteins

SummaryBackgroundGeneration of membrane curvature is critical for the formation of plasma membrane protrusions and invaginations and for shaping intracellular organelles. Among the central regulators of membrane dynamics are the BAR superfamily domains, which deform membranes into tubular structures. In contrast to the relatively well characterized BAR and F-BAR domains that promote the formation of plasma membrane invaginations, I-BAR domains induce plasma membrane protrusions through a poorly understood mechanism.ResultsWe show that I-BAR domains induce strong PI(4,5)P2 clustering upon membrane binding, bend the membrane through electrostatic interactions, and remain dynamically associated with the inner leaflet of membrane tubules. Thus, I-BAR domains induce the formation of dynamic membrane protrusions to the opposite direction than do BAR and F-BAR domains. Strikingly, comparison of different I-BAR domains revealed that they deform PI(4,5)P2-rich membranes through distinct mechanisms. IRSp53 and IRTKS I-BARs bind membranes mainly through electrostatic interactions, whereas MIM and ABBA I-BARs additionally insert an amphipathic helix into the membrane bilayer, resulting in larger tubule diameter in vitro and more efficient filopodia formation in vivo. Furthermore, FRAP analysis revealed that whereas the mammalian I-BAR domains display dynamic association with filopodia, the C. elegans I-BAR domain forms relatively stable structures inside the plasma membrane protrusions.ConclusionsThese data define I-BAR domain as a functional member of the BAR domain superfamily and unravel the mechanisms by which I-BAR domains deform membranes to induce filopodia in cells. Furthermore, our work reveals unexpected divergence in the mechanisms by which evolutionarily distinct groups of I-BAR domains interact with PI(4,5)P2-rich membranes

Structural insight into African horsesickness virus infection

African horsesickness (AHS) is a devastating disease of horses. The disease is caused by the double-stranded RNA-containing African horsesickness virus (AHSV). Using electron cryomicroscopy and three-dimensional image reconstruction, we determined the architecture of an AHSV serotype 4 (AHSV-4) reference strain. The structure revealed triple-layered AHS virions enclosing the segmented genome and transcriptase complex. The innermost protein layer contains 120 copies of VP3, with the viral polymerase, capping enzyme, and helicase attached to the inner surface of the VP3 layer on the 5-fold axis, surrounded by double-stranded RNA. VP7 trimers form a second, T 13 layer on top of VP3. Comparative analyses of the structures of bluetongue virus and AHSV-4 confirmed that VP5 trimers form globular domains and VP2 trimers form triskelions, on the virion surface. We also identified an AHSV-7 strain with a truncated VP2 protein (AHSV-7 tVP2) which outgrows AHSV-4 in culture. Comparison of AHSV-7 tVP2 to bluetongue virus and AHSV-4 allowed mapping of two domains in AHSV-4 VP2, and one in bluetongue virus VP2, that are important in infection. We also revealed a protein plugging the 5-fold vertices in AHSV-4. These results shed light on virus-host interactions in an economically important orbivirus to help the informed design of new vaccines

Structures of enveloped virions determined by cryogenic electron microscopy and tomography : Advances in Virus Research

Enveloped viruses enclose their genomes inside a lipid bilayer which is decorated by membrane proteins that mediate virus entry. These viruses display a wide range of sizes, morphologies and symmetries. Spherical viruses are often isometric and their envelope proteins follow icosahedral symmetry. Filamentous and pleomorphic viruses lack such global symmetry but their surface proteins may display locally ordered assemblies. Determining the structures of enveloped viruses, including the envelope proteins and their protein-protein interactions on the viral surface, is of paramount importance. These structures can reveal how the virions are assembled and released by budding from the infected host cell, how the progeny virions infect new cells by membrane fusion, and how antibodies bind surface epitopes to block infection. In this chapter, we discuss the uses of cryogenic electron microscopy (cryo-EM) in elucidating structures of enveloped virions. Starting from a detailed outline of data collection and processing strategies, we highlight how cryo-EM has been successfully utilized to provide unique insights into enveloped virus entry, assembly, and neutralization.Peer reviewe

Managing closets : Upper-middle-class LGBT youth in globalizing Mumbai

The aim of the thesis is to study globalization and what it means in the context of contemporary Mumbai, by focusing on the lives of young, LGBT identified people, who are a part of the gay community there. The thesis takes as its starting point the idea of the closet and it deals with how upper-middle-class young people manage their closets and the reasons why they create them. The main research method used is participant observation. The research is based on a three-month fieldwork in Mumbai among LGBT youth and the organization Humsafar Trust, by taking part in the events organized by the organization and meeting people in them. The first analysis chapter introduces the larger context of globalization and postcolonial identities. It describes how being gay has been labeled as foreign by the Hindu nationalist movement, and introduces theories that explain how nation building and sexuality and closely connected. The work of Peter Jackson is then introduced, who argues that new norms of cultural difference are emerging simultaneously with transnational queer cultural patterns. In line with Jackson, the thesis criticizes Dennis Altman’s idea of a global gay culture, by arguing that while the LGBT movement has borrowed certain characteristics from the American LGBT movement, they have been adjusted to suit the conditions in Mumbai. The thesis argues that overall there exists a lack of knowledge concerning alternative sexualities among the middle class and that people have many misconceptions about them. The reasons why young people choose to stay in the closet at home have a lot to do with the importance of marriage in a middle-class household and the importance of respecting the wishes of one’s family. This managing of the closet allows young LGBT people to simultaneously respect middle-class Indian family values but also act out their individual sexual identity. It is also argued that even if the child chooses to come out to their parents, they face taunting from other parts of society. The thesis argues that deciding whether to be in or out of the closet has a lot to do with globalization. As a result of being in growing contact with foreign influences, the middle class in Mumbai has become afraid of losing their sense of self – the joint family. The young LGBT youth become the bodies through which ideas of modern and tradition and national identity are discussed. Another conclusion is that the socio-economical status of the informants is a key factor in how my they experience things in the world. Being upper-middle-class gives them access to spaces where acting gay is not frowned upon as much, such as the mall, or where it is celebrated, such as the office of a LGBT focused organization. It also gives them access to Internet, which turned out to be crucial if one wants to take part in LGBT events around Mumbai. The argument here is that globalization in Mumbai has simultaneously excluded a big part of the LGBT community but also created safe spaces for those who can access them.Tutkielman tarkoitus on tutkia globalisaatiota ja ymmärtää millaisia muotoja se saa nykyhetken Mumbaissa keskittymällä LHBT- vähemmistöihin identifioituviin keskiluokkaisiin nuoriin, jotka osallistuvat aktiivisesti paikallisen seksuaalivähemmistöliikkeen tapahtumiin. Tutkielma ottaa lähtökohdaksi kaapista tulemisen metaforan, ja käsittelee sitä miten ylempää keskiluokkaa olevat nuoret hallitsevat kaappejaan ja syitä sille miksi he luovat niitä. Tutkimuksen pääasiallinen metodi on osallistuva havainnointi. Tutkielma perustuu kolmen kuukauden mittaiseen kenttätyöhön Mumbaissa seksuaalivähemmistöihin identifioituvien nuorten parissa ja Humsafar Trust-järjestössä osallistumalla järjestön järjestämiin tapahtumiin ja tapaamalla niissä ihmisiä. Ensimmäinen analyysiluku esittelee laajemman kontekstin, johon liittyy globalisaatio ja postkoloniaaliset identiteetit. Luvussa kuvaillaan kuinka hindunationalistinen liike on leimannut homoseksuaalisuuden ulkomaiseksi, ja esitellään teorioita jotka selittävät miten kansallisidentiteetin rakentaminen ja seksuaalisuus ovat yhteydessä toisiinsa. Luvussa esitellään Peter Jacksonin näkökulma siitä, miten uusia kulttuuristen eroavaisuuksien normeja syntyy samanaikaisesti transnationaalien queer-kulttuurimallien kanssa. Jacksonin argumentteihin perustuen tutkielma kritisoi Dennis Altmanin ideaa globaalista gay-kulttuurista. Sen sijaan, että Mumbain LGBT-liike olisi kopio amerikkalaisesta vastineestaan, liike on ennemminkin lainannut tiettyjä elementtejä, mutta soveltanut niitä omaan kontekstiinsa. Tutkielman mukaan Mumbaissa asuvalla keskiluokalla ei oikestaan ole tietoa vaihtoehtoisista seksuaalisuuksista. Tästä huolimatta se, miksi nuori päättää ‘pysyä kaapissa’ kotonaan, liittyy ennemminkin siihen, miten tärkeänä avioliittoa ja perhearvoja pidetään keskiluokan keskuudessa. Pitämällä seksuaalisuutensa salassa vanhemmiltaan nuorten on mahdollista samanaikaisesti kunnioittaa keskiluokkaisia perhearvoja ja toteuttaa yksilöllistä seksuaalista identiteettiään. On kuitenkin totta, että vaikka nuori olisi vanhemmilleen avoin seksuaalisuudestaan, hän todennäköisesti kohtaa syrjintää muualla yhteiskunnassa. Päätökset, joita nuoret tekevät kaapissa pysymisen tai sieltä ulos tulemisen suhteen, liittyvät olennaisesti globalisaatioon. 90- luvun taloudellisten muutosten jälkeen Intiaan on virrannut tiheämmin ulkomaisia vaikutteita, ja tämän seurauksena keskiluokka on huolestunut ainutlaatuisen kulttuurinsa häviämisestä. He pelkäävät ikään kuin menettävänsä osan intialaisuudesta – perinteisen sukulaisuusjärjestelmän. Nuorista seksuaalivähemmistöihin identifioituituvista nuorista tulee näin keinoja käsitellä moderniutta, perinteitä ja kansallista identiteettiä. Tutkielma myös esittää, että informanttien sosioekonominen tausta on oleellinen tekijä siinä, miten he kokevat ympäristönsä. Kuulumalla ylempään keskiluokkaan heillä on pääsy paikkoihin, joissa heteroseksuaalisuudesta poikkeava käytös ei ole yhtä paheksuttua kuin muualla yhteiskunnassa. Tutkielman mukaan tällaisia paikkoja ovat esimerkiksi yläluokkaiset ostoskeskukset sekä paikat joissa vaihtoehtoisia seksuaalisuuksia jopa ihannoidaan, kuten LHBT -järjestöjen toimistot. Nuorten sosioekonominen tausta myös mahdollistaa sen, että heillä on pääsy Internetiin, mikä osoittautukin oleelliseksi osaksi yhteisön kommunikaatiota. Globalisaatio on näin ollen samanaikaisesti sulkenut ulkopuolelle tietystä sosiaalisesta luokasta tulevat seksuaalivähemmistöt ja toisaalta se on auttanut luomaan turvallisia paikkoja olla oma itsensä nuorille, joilla niihin on pääsy

Cryo-EM in structural virology : dissecting the icosahedral capsid

Technological advances especially in the last two decades have made it feasible to study virus structures to atomic or near-atomic resolution by a combination of cryogenic electron microscopy (cryo-EM) and image reconstruction or by X-ray crystallography. Drawing from these data, intertwined concepts of “viral self” and structure-based viral lineages been put forward and refined during the last decade. In order to address these theories, I used cryo-EM, 3D image reconstruction, homology modelling and de novo atomic modelling of proteins to study five viruses with icosahedrally symmetric protein capsids. The capsid structures of bacteriophage Bam35, two African horse sickness virus serotypes (AHSV-4 and AHSV-7 tVP2), archaeal head-tailed virus HSTV-1, and Nora virus (NORAV) that infects Drosophila melanogaster were solved to subnanometer resolution. I examine the methodological advances in the field of cryoEM and image processing that have occurred over the time span of the original articles included in the thesis, giving an empirical perspective on the important changes required to reach atomic resolution in virus structural determination. These included improved imaging, data recording, automation, and software developments. Notably, grid preparation is the area where the next strides need to be made to improve reproducibility and throughput. The results contribute to the general field of structural virology as well as shedding light into more specific areas, such as biological membrane modulation, archaeal viruses and vaccine development. Moreover, the hosts of the viruses studied span all three domains of life (bacteria, archaea and eukaryotes). This unusually wide sampling of the viral universe, or virosphere, creates an excellent basis for testing the utilisation of capsid structure in structure-based virus classification as well as verification of structure-based viral lineages. The results allowed unambiguous structure-based classification of the five studied viruses into the four previously postulated virus lineages; the picornavirus-like lineage, the HK97-like tailed-phage lineage, the PRD1/adenovirus lineage and the icosahedral dsRNA virus lineage. Furthermore, the NORAV reconstruction at 2.7 Å resolution provided structural evidence suggesting that NORAV is a representative of a new virus family within the order Picornavirales; a result not achievable by genetic evidence alone and a benchmark example of structure-based virus classification.Virusten rakenteiden tarkka kuvantaminen on mahdollista käyttäen kryogeenista elektronimikroskopiaa (kryo-EM) tai vaihtoehtoisesti röntgenkristallografiaa. Alan teknologinen kehitys viimeisen kahden vuosikymmenen aikana on ollut merkittävää, ja saatujen tulosten perusteella on kehitetty hypoteeseja virusten pohjimmaisesta olemuksesta sekä virusten kuorirakenteisiin perustuvista sukulinjoista. Väitöskirjassani tarkastelen viiden viruksen rakennetta näiden teorioiden valossa. Käytin kryogeenista elektronimikroskopiaa, tiheyskartan rekonstruointia, proteiinirakenteita vertailevaa mallinnusta ja de novo proteiinirakenteen mallinnusta viiteen virioniin joiden kuorirakenteet noudattavat 20 -tahoista eli ikosahedraalista symmetriaa. Selvitimme yhtä nanometriä paremmalla erotuskyvyllä kuorirakenteen bakteerivirus Bam35:stä, kahdesta afrikkalaista hevosruttoa aiheuttavasta viruksesta (AHSV-4 ja AHSV-7 tVP2), arkeoneja infektoivasta viruksesta (HSTV-1) ja Drosophila melanogaster -kärpästä infektoivasta Nora -viruksesta (NORAV). Työssäni tarkastelen kryo-EM-kuvantamis- ja rekonstruktiomenetelmien kehitystä alkuperäisjulkaisujen kattamalta ajanjaksolta. Pitkälle ajanjaksolle levittäytyvien tutkimustulosten rinnakkaisvertailu avaa yleisnäkymän niihin kriittisiin kehitysaskeliin jotka ovat olleet tarpeen atomiresoluution saavuttamisessa kryo-EM:ään perustuvassa virusten rakennetutkimuksessa. Nämä kehitysaskeleet perustuvat parannuksiin kuvan muodostuksessa, kuvan tallennusmenetelmissä, automaatiossa ja ohjelmistoissa. Näytehilojen valmistaminen näyttäytyy tärkeänä tulevaisuuden kehitysalueena. Saavutetut tutkimustulokset edistävät yleisemmällä tasolla rakennevirologian tietämystämme, valottaen lisäksi kapea-alaisempia kysymyksiä liittyen mm. biologisten kalvorakenteiden vuorovaikutuksiin, arkeonien viruksiin ja rokotuskehitykseen. Tutkittujen virusten isäntäsolut kattavat kaikki kolme eliökunnan päähaaraa (bakteerit, arkeonit ja aitotumalliset). Tämä virusten maailman, virosfäärin, laaja-alainen kattavuus tarjoaa erinomaiset lähtökohdat rakenteeseen perustuvan virusluokittelun käytännön kokeiluun sekä jo olemassa olevien luokitteluhypoteesien varmentamiseen. Tulokset mahdollistivat kaikkien viiden tutkitun viruksen kiistattoman luokittelun neljään aikaisemmin esitettyyn rakennepohjaiseen sukulinjaan: pikornavirusten kaltaisten virusten sukulinjaan, HK97-viruksen kaltaisten hännällisten faagien sukulinjaan, PRD1/adenovirus-sukulinjaan ja ikosahedraalisten kaksijuoste-RNA-virusten sukulinjaan. Lisäksi NORAV:n 2,7 Ångströmin tarkkuuden saavuttanut rakenne osoittaa että kyseinen virus edustaa aikaisemmin tuntematonta virusperhettä Picornavirales-lahkossa. Tutkimustulokseen ei olisi päästy pelkin geneettisin menetelmin ja se on erinomainen esimerkki rakennepohjaisesta virusluokittelusta