Biological characterization, molecular and analysis of genetic variability of Cowpea mild mottle virus (CPMMV) in soybean in Brazil

A partir do ano 2000 plantas de soja nos campos dos estados da Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná e Tocantins foram descritasapresentando sintomas da doença da necrose da haste da soja. Os sintomas eram variados, alguns mais suaves outros mais severos. A doença foi associada ao Cowpea mild mottle virus (CPMMV, família Betaflexiviridae, gênero Carlavirus). Nesse estudo foi proposta a realização da caracterização biológica, molecular e análise da variabilidade genética de isolados de CPMMV, causando sintomas da necrose da haste em soja nos campos de diferentes estados produtores do Brasil. O estudo foi realizado com amostras coletadas nos estados da Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Minas Gerais e Pará. Os isolados causaram uma variedade de sintomas em soja cv. CD206, isolados brandos e severos foram observados. O genoma completo de 6 isolados foi sequenciado e adicionalmente a sequencia parcial de outros 12 isolados foi também determinada (ORF2-3 terminal). Nenhum isolado brasileiro de CPMMV, independente do hospedeiro, havia sido totalmente sequenciado até esse trabalho. As caracterizações biológica e molecular mostraram que os seis isolados brasileiros, cujos genomas foram completamente determinados, pertencem a uma nova estirpe de CPMMV, distinta daquela à qual pertence o único isolado de CPMMV previamente sequenciado, oriundo de Gana na Àfrica. A ORF1 (RdRp) desses seis isolados brasileiros apresentou valores de identidade de sequencia (60- 61% para nt e 58-69% para aa), inferiores ao estabelecido pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), quando foram comparados com o isolado Gana de CPMMV. A ORF5 (CP), no entanto, apresentou valores de identidade (79% para nt e 95-96% para aa) superiores ao estabelecido pelo ICTV quando foram comparados com o isolado Gana. Ambas as proteínas são utilizadas para classificar isolados do gênero Carlavirus em uma mesma espécie. As comparações par-a-par e análises filogenéticas mostraram que os isolados brasileiros são altamente relacionados entre si e distintos de isolados de outras espécies do gênero Carlavirus. As árvores filogenéticas construídas com as sequencias parciais dos genomas não mostraram agrupamentos com base em região geográfica ou ano de coleta, porém agrupamentos com base nos sintomas foram observados para as árvores construídas com a sequência parcial (ORF2-3 terminal), ORF2 (TGB1), ORF5 (CP) e ORF6 (NABP). Além do relacionamento entre os isolados de CPMMV, foi demonstrado através do sequenciamento parcial, que existem variações entre os isolados brasileiros. Evidencias de duas possíveis estirpes de CPMMV no Brasil foram encontradas, com variações moleculares e biológicas entre os isolados de ambas as estirpes. Eventos de recombinação foram identificados ao longo do genoma dos isolados, e eles ocorreram principalmente na ORF1, região da polimerase, e com menor frequência em outras regiões genoma. Com esse trabalho foi verificado que o critério taxonômico, que define as espécies do gênero Carlavirus, pode ser falho em casos em que apenas a sequencia parcial é determinada, se apenas a ORF1 tivesse sido determinada durante o estudo poderíamos propor que os nossos isolados pertencem à uma nova espécie do gênero Carlavirus. Além disso, ficou clara a necessidade de se determinar a ocorrência de transmissão por semente dos isolados de CPMMV brasileiros, pois a transmissão por sementes e/ou a alta capacidade de dispersão e voo da mosca branca Bemisia tabaci podem ter contribuído para a dispersão do vírus nos diferentes estados produtores de soja. Esses fatos justificam o não agrupamento dos isolados com base em região geográfica ou ano de coleta.Since 2000, field soybean plants in the states of Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná and Tocantins have been described with symptoms of soybean stem necrosis disease. The symptoms are varied, some milder other severe. The disease has been associated with Cowpea mild mottle virus (CPMMV, family Betaflexiviridae, genus Carlavirus). This study is aimed at the biological characterization and molecular and genetic analyses of genetic variability of isolates of CPMMV that cause symptoms of stem necrosis in soybean fields of different producing Brazil states. The study was conducted with samples collected in the states of Bahia, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Minas Gerais and Pará. The isolates caused a variety of symptoms in soybean cv. CD206, and mild and severe isolates were observed. The complete genomes of six isolates were sequenced and additionally the partial sequence of another 12 isolates was also determined (ORF2- 3'end). No Brazilian CPMMV isolate, from any host, had been entirely sequenced until now. Biological and molecular characterization showed that the six Brazilian isolates, whose genomes have been completely determined, belong to a new CPMMV strain distinct from that which belongs to the only isolated CPMMV previously sequenced from Ghana in Africa. The ORF1 (RdRp) of these six Brazilian isolates showed values of sequence identity (60-61% to 58-69% for nt and aa), less than that set by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), when they were compared with a Ghanaian CPMMV isolate. ORF5 (CP), however, showed identity values (79% to 95-96% for nt and aa) greater than those established by the ICTV when they were compared with the Ghanaian isolate. Both proteins are used to classify isolates of the genus Carlavirus in the same species. Pairwise comparisons and phylogenetic analysis showed that Brazilian isolates are highly related to each other and distinct from isolates of other species of the genus Carlavirus. The phylogenetic trees constructed with partial sequences of the genomes did not show groupings based on geographic region or collection year, but groupings based on symptoms were observed for trees constructed with partial sequences (ORF2-3'end), ORF2 (TGB1), ORF5 (CP) and ORF6 (NABP). Besides the relationship between isolates CPMMV demonstrated by partial sequencing, there are variations between the Brazilian isolates. Evidence of two possible CPMMV strains were found in Brazil with biological and molecular variations between isolates of both strains. Recombination events were identified in genome of the isolates, and they occurred mainly in the ORF1 region of the polymerase, less frequently in other regions of the genome. With this study it was found that the taxonomic criteria, which define the genus Carlavirus may fail in cases where only a partial sequence is determined: if only the ORF1 had been determined during the study we could propose that our isolates belong to a new species of the genus Carlavirus. In addition, there is clearly the need to determine the occurrence of seed transmission in Brazilian CPMMV isolates, since the transmission by seed and/or whitefly Bemisia tabaci, with high dispersibility may have contributed to the spread of the virus in different soybean producing states. These facts justify the nongrouping of isolates based on geographic region or collection year.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

Novas descobertas sobre a infecção do Cowpea mild mottle virus (CPMMV) em soja: o envolvimento da replicase viral na indução de sintomas e sua interação com fatores do hospedeiro

Cowpea mild mottle virus (CPMMV, family Betaflexiviridae and genus Carlavirus) is an emerging virus in Brazil. The virus is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci and it infects hosts preferentially of Fabaceae family, being found in different crops in almost all the continents in the world. In this work, several aspects about biology and genetics of CPMMV were dicussed and the CPMMV-host relationship was explored. CPMMV causes varied symptoms in plants in the fields and in greenhouse. The nature of this symptoms variation was determinate in this work using successive inoculations of a CPMMV Brazilian isolate causing necrosis in the CD206 soybean cultivar. Successive inoculations led to the isolate, which previously had caused necrosis to induce mild symptoms (mosaic and vein clearing). This was verified after six successive inoculations of a soybean sample from the field and also from a local lesion of a viral isolate, and thus submitted to a genetic bottleneck, in Nicotiana benthamiana leaves. We have shown that altering of symptoms pattern increased the fitness of the virus and vector, suggesting that the induction of different symptoms by viral variants is an adaptive advantage. The viral region involved in the induction of CPMMV symptoms was viral replicase (encoded by ORF1), different sites distributed throughout the recombinant blocks of ORF1 were associated with phenotype changes. In this work, also shought to the understanding about the replication of CPMMV in soybean identifying factors necessary for replication. To date, all that has been known about betaflexiviruses’s replication is that it occurs in the cytoplasm. None host factor was known. Here, two host proteins able to interact with the RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp) from a yeast two-hybrid vector-constructed soybean cDNA library were indentifyed. For the library construction, soybean plants cv. CD206 with CPMMV infection after 0, 3, 7 and 14 days of inoculation were used. The proteins identified were: the CSC1 type ERD4 (GmERD4) and an inositol methyltransferase (GmIMT). The interaction was confirmed by yeast two-hybrid assays and by Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) assays. Prediction and subcellular localization of both proteins and the RdRp domain were also performed. GmERD4 was located in the endoplasmic reticulum (ER), GmIMT presented cytoplasmic location while the RdRp domain induced punctual structures in the plasma membrane and on the ER network. Analysis of the expression of both genes in soybean plants infected with CPMMV demonstrated that the they were induced after 3 and 7 days of inoculation. Overexpression of GmERD4 and GmIMT was performed on soybean protoplasts infected with CPMMV and it was found that overexpression of GmERD4 increased viral accumulation after 7 days of infection. Viral replicase is involved in different viral infection processes, acting not only on genome replication, but also on the induction of symptoms. This reinforces the multifunctional nature of viral proteins.O Cowpea mild mottle virus (CPMMV, família Betaflexiviridade e gênero Carlavirus) é um vírus emergente no Brasil. O vírus é transmitido pela mosca-branca Bemisia tabaci e infecta hospedeiros preferencialmente da família Fabaceae, sendo encontrado em diferentes culturas em quase todos os continentes do mundo. Nesse trabalho, vários aspectos da biologia e genética do CPMMV foram discutidos e a relação CPMMV- hospedeiro foi explorada. O CPMMV causa sintomas muito variados em plantas campo e em casa de vegetação. A natureza dessa variação de sintomas foi determinada nesse trabalho utilizando-se inoculações sucessivas de um isolado de CPMMV brasileiro causador de necrose na cultivar de soja CD206. As inoculações sucessivas levaram o isolado que antes causava necrose a induzir sintomas brandos (mosaicos e clareamento de nervuras). Isso foi verificado após seis inoculações sucessivas de uma amostra vegetal de soja proveniente do campo e também a partir do isolado viral oriundo de uma lesão local, e submetido, portanto a um gargalo genético, em folhas de Nicotiana benthamiana. A alteração do padrão de sintomas aumentou adaptabilidade do vírus e vetor, sugerindo que a indução de diferentes sintomas pelos variantes virais é uma vantagem adaptativa. A região viral envolvida na indução de sintomas pelo CPMMV foi a replicase viral (codificada pela ORF1) e diferentes sítios distribuídos ao longo de blocos recombinantes da ORF1 foram associados às alterações do fenótipo. Nesse trabalho, também se buscou compreender um aspectos da replicação do CPMMV em soja, identificando-se fatores necessários à replicação. Até o momento tudo que se sabia sobre a replicação dos betaflexivírus é que ela ocorria no citoplasma. Nenhum fator do hospedeiro era conhecido. Aqui foram identificadas duas proteínas do hospedeiro capazes de interagir com o domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) a partir de uma biblioteca de cDNA de soja construída em vetor de duplo-híbrido de leveduras. Para a construção da biblioteca foram utilizadas plantas de soja cv. CD206 com infecção pelo CPMMV após 0, 3, 7 e 14 dias de inoculação. As proteínas identificadas foram: a ERD4 tipo CSC1 (GmERD4) e uma inositol metiltransferase (GmIMT). A interação foi confirmada por ensaios de duplo-híbrido de leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A predição e a localização subcelular de ambas as proteínas e do domínio RdRp também foram realizados. GmERD4 localizou-se no retículo endoplasmático (RE) e GmIMT apresentou localização citoplasmática, enquanto o domínio RdRp induziu estruturas pontuais na membrana plasmática e sobre a rede do RE. A análise da expressão de ambos os genes em plantas de soja infectadas com o CPMMV, demonstrou que eles foram induzidos após 3 e 7 dias da inoculação. A superexpressão de GmERD4 e GmIMT foi realizada em protoplastos de soja infectados com o CPMMV e foi verificado que a superexpressão de GmERD4 aumentou o acúmulo viral após 7 dias de infecção. A replicase viral está envolvida em diferentes processos da infecção viral, atuando não apenas na replicação dos genomas, mas também na indução de sintomas. Isso reforça a natureza multifuncional das proteínas virais.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

The soybean rust pathogen Phakopsora pachyrhizi displays transposable element proliferation that correlates with broad host-range adaptation on legumes

ABSTRACTAsian soybean rust, caused by Phakopsora pachyrhizi, is one of the world’s most economically damaging agricultural diseases. Despite P. pachyrhizi’s impact, the exceptional size and complexity of its genome prevented generation of an accurate genome assembly. We simultaneously sequenced three P. pachyrhizi genomes uncovering a genome up to 1.25 Gb comprising two haplotypes with a transposable element (TE) content of ~93%. The proliferation of TEs within the genome occurred in several bursts and correlates with the radiation and speciation of the legumes. We present data of clear de-repression of TEs that mirrors expression of virulence-related candidate effectors. We can see a unique expansion in amino acid metabolism for this fungus. Our data shows that TEs play a dominant role in P. pachyrhizi’s genome and have a key impact on various processes such as host range adaptation, stress responses and genetic plasticity of the genome

Major proliferation of transposable elements shaped the genome of the soybean rust pathogen Phakopsora pachyrhizi

Asian soybean rust caused by Phakopsora pachyrhizi is an important plant pathogen, but an accurate genome assembly for this fungus has been lacking. This study sequenced three independent P. pachyrhizi isolates and generated reference quality assemblies and genome annotations, representing a critical step for further in-depth studies of this pathogen and the development of new methods of control