Identificação por ultrafiltração acoplada à CLUE-EM de ligantes enzimáticos de apirase a partir de fontes naturais e avaliação da sua atividade esquistossomicida in vitro e in vivo

The present work describes the identification of natural potato apyrase ligands, which may be potential schistosomicidal substances, through the ultrafiltration (UF) coupled with CLUE-ESI-QTOF-EM. In addition, in vitro and in vivo schistosomicidal activity of selected plant extracts and isolated substances were evaluated. Firstly, cardamonin, a substance with in vitro schistosomicidal and with potential to inhibit the activity of ATP diphosphohydrolases, was evaluated in the in vivo schistosomicidal assay and used to select the incubation conditions for the UF technique. Then some extracts produced were incubated with potato apyrase and submitted to UF coupled with CLUE-ESI-QTOF-EM. The chromatographic peaks of the ligands of apyrase were selected for further fractionation of the plant extracts and isolation and purification of these ligand substances. The isolated substances were evaluated in the potato apyrase inhibition activities assays, as well as in vitro and in vivo schistosomicidal assays. The results this study showed that the cardamonin binds and inhibits the potato apyrase enzymatic activity, with IC50 of 49 M. In addition, in a mouse model of schistosomiasis, cardamonin (400mg/kg) was able to reduce the total number of worms recovered in 46.81% and the number of immature eggs in 62.44%. As a result of the UF coupled with CLUE-ESI-QTOF-EM, the screening of samples for the selection of potential ligands and inhibitors of the potato apyrase enzyme resulted in the selection of 3 plant extracts of the species Ruta graveolens L. (Rutaceae), Acmella oleracea L. (Asteraceae) and Centela erecta L. (Apiaceae). From these extracts we isolate the ligands arborinine, spilanthol and asiaticoside, respectively. Regarding the enzymatic activity, when evaluated at 25 M, arborinine, spilanthol and asiaticoside, were able to inhibit the enzyme by 31.32%, 77.29% and 33.23%, respectively. In the in vitro schistosomicidal assay, the Rg-F4 fraction from R. graveolens extract and the A. oleracea extract caused the death of all parasites after 24h and 48h of incubation. C. erecta extract (100 μg/mL) caused only the death of male worms, while females had only a small reduction in motor activity after 24h of incubation, and all parasites were killed after 48h of incubation. Spilanthol (100 μM) caused the death all parasites after 24h of incubation. Asiaticoside (400mg/kg), when evaluated in the in vivo schistosomicide assay, was able to reduce in 65.43% the number of worms recovered and and 67.87% the number of eggs per gram of feces. The results obtained in this study with cardamonin suggest that apyrase may be used as a target molecule in screening studies to find S. mansoni ATP diphosphohydrolases ligands and possible inhibitors, from herbal extracts. In addition, further studies to investigate are important to investigate the in vivo schistosomicidal activity of arborinine and spilanthol.O presente trabalho descreve a identificação de ligantes naturais da enzima apirase de batata, os quais podem ser potenciais substâncias esquistossomicidas, por meio da ultrafiltração (UF) acoplada à CLUE-ESI-QTOF-EM. Avaliou-se também a atividade esquistossomicida in vitro e in vivo de extratos vegetais selecionados e substâncias isoladas. Primeiramente, a cardamonina, substância com atividade esquistossomicida in vitro e com potencial de inibição da atividade das ATP difosfohidrolases, foi avaliada frente à sua atividade esquistossomicida in vivo e utilizada para selecionar as condições de incubação para a técnica de UF. Em seguida alguns extratos produzidos foram incubados com a apirase de batata e submetidos à UF acoplada a CLUE-ESI-QTOF-EM. Os picos cromatográficos dos ligantes da apirase foram selecionados para posterior fracionamento dos extratos vegetais e isolamento e purificação destas substâncias ligantes. As substâncias isoladas foram avaliadas frente à enzima apirase de batata e em ensaios esquistossomicidas in vitro e in vivo. Os resultados deste estudo demonstram que a cardamonina possui capacidade de se ligar e inibir a atividade enzimática da apirase de batata, apresentando IC50 de 49 M. Além disso, em modelo murino, a cardamonina (400mg/kg) foi capaz de reduzir em 46,81% o número total de vermes recuperados e 62,44% o número de ovos imaturos. Como resultado dos ensaios de UF acoplada à CLUE-ESI-QTOF-EM, o screening de amostras para seleção de potenciais ligantes e inibidores da enzima apirase de batata resultou na seleção de 3 extratos vegetais das espécies Ruta graveolens L. (Rutaceae), Acmella oleracea L. (Asteraceae) e Centela erecta L. (Apiaceae). Destes extratos isolaram-se os ligantes arborinina, espilantol e asiaticosídeo, respectivamente. Em relação à atividade enzimática, quando avaliados a 25 M, a arborinina, o espilantol e o asiaticosídeo foram capazes de inibir a enzima em 31,32%, 77,29% e 33,23%, respectivamente. No estudo esquistossomicida in vitro a fração Rg-F4, oriunda do extrato de R. graveolens, e o extrato de A. oleracea, causaram a morte de todos os parasitos após 24h e 48h de incubação. O extrato de C. erecta (100 μg/mL) causou a morte somente dos vermes machos, enquanto as fêmeas tiveram apenas pequena redução da atividade motora, após 24h de incubação, sendo todos os parasitos mortos após 48 h de incubação. O espilantol (100 μM) causou a morte de todos os parasitos após 24 h de incubação. Já o asiaticosídeo (400mg/kg), quando avaliado no ensaio esquistossomicida in vivo, foi capaz de reduzir em 65,43% o número de vermes recuperados e, em 67,87% o número de ovos por grama de fezes. Os resultados obtidos neste estudo com a cardamonina sugerem que a apirase pode ser utilizada como molécula alvo em estudos de triagem para encontrar ligantes e possíveis inibidores das ATP difosfohidrolases de S. mansoni, a partir de extratos vegetais. Além disso, torna-se importante estudos adicionais para a investigação da atividade esquistossomicida in vivo da arborinina e do espilantol

Avaliação dos efeitos do ácido caurenoico e do partenolido sobre a produção de citocinas e óxido nítrico em células de camundongos C57Bl/6 após indução da EAE

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease, chronic, progressive, inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS) that affects 2.5 million people worldwide. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most accepted model for studying the pathogenesis of MS due to its clinical and histopathologic similarity to this disease. Both have pathophysiological processes mediated by Th1 and Th17 cells, with production of pro-inflammatory cytokines such as interferon-gamma (IFN-), Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α) and interleukin 17 (IL-17) and mediated nitric oxide (NO), mainly produced by macrophages. Currently used medications for MS act on some of these inflammatory mediators, but due to the high cost and adverse effects displayed becomes necessary to search for new substances which are capable of modulating the production of these inflammatory mediators. Thus, in the present study investigated the in vitro effect immunomodulatory of the kaurenoic acid and parthenolide on the production of NO, TNF-α, IFN-, IL-17 and Interleukin 6 (IL-6) in splenocyte cultures of mice induced with EAE. For this, EAE was induced in female C57Bl/6 with MOG35-55 and animals were euthanized on the 22th day post induction for obtaining splenocytes. These cells restimulated with MOG35-55 and lipopolysaccharide (LPS) were given the substances tested at three different concentrations (25, 50 and 100 µM for kaurenoic acid and 1, 5 and 20 µM for the parthenolide). The kaurenoic acid reduced the levels of NO, TNF-α, IFN-, IL-6 and IL-17 at the two highest concentrations tested. Parthenolide was able decrease the production of IL-6 in all tested concentrations, although the NO and IL-17, was only decreased by the two highest concentration and TNF-α, IFN was decreased only the highest concentration analyzed. The results obtained in this study suggest that kaurenoic acid and parthenolide may modulate the production of inflammatory mediators, demonstrate the great potential of these substances as prototypes for the development of new approaches in EAE, an animal model of MS.A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune, crônica, progressiva, inflamatória e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) que afeta 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo mais aceito para o estudo da patogênese da EM, devido à sua similaridade clínica e histopatológica a esta doença. Ambas apresentam processos fisiopatológicos mediados por células Th1 e Th17, com produção de citocinas próinflamatórias, como Interferon-gama (IFN-), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interleucina 17 (IL-17) e pelo óxido nítrico (NO), produzido principalmente por macrófagos. Atualmente, os medicamentos utilizados para a EM atuam sobre alguns desses mediadores inflamatórios, porém devido ao alto custo e efeitos adversos apresentados torna-se necessária a busca por novas terapias que sejam capazes de modular a produção destes mediadores inflamatórios. Assim, no presente trabalho, investigou-se o efeito imunomodulatório in vitro do ácido caurenoico e do partenolido sobre a produção de NO, TNF-α, IFN-, IL-17 e Interleucina 6 (IL-6) em culturas de esplenócitos de camundongos induzidos com EAE. Para isso, a EAE foi induzida em fêmeas de camundongos C57Bl/6 com MOG35-55 e após 22 dias da indução elas foram eutanasiadas para obtenção dos esplenócitos. Estas células, reestimuladas com MOG35-55 e lipopolissacarídeo (LPS), receberam as substâncias testadas em três concentrações diferentes (25, 50 e 100 µM para o ácido caurenoico, e 1, 5 e 20 µM para o partenolido). O ácido caurenoico reduziu os níveis de NO, TNF-α, IFN-, IL-6 e IL-17 nas duas maiores concentrações avaliadas. O partenolido diminuiu a produção de IL-6 nas três concentrações, de NO e IL-17 nas duas maiores concentrações e de TNF-α, IFN- somente na maior concentração avaliada. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o ácido caurenoico e o partenolido podem modular a produção dos mediadores químicos em questão, demonstrando o grande potencial destas substâncias para o desenvolvimento de novas abordagens na EAE, modelo animal da EM

Identification of Asiaticoside from Centella erecta (Apiaceae) as Potential Apyrase Inhibitor by UF-UHPLC-MS and Its In Vivo Antischistosomal Activity

Schistosomiasis, caused by parasites of the genus Schistosoma, is a neglected disease with high global prevalence, affecting more than 240 million people in several countries. Praziquantel (PZQ) is the only drug currently available for the treatment. S. mansoni NTPDases (known as SmNTPDases, ATP diphosphohydrolases or ecto-apyrases) are potential drug targets for the discovery of new antischistosomal drugs. In this study, we screen NTPDases inhibitors from Centella erecta (Apiaceae) using an ultrafiltration combined UHPLC-QTOF-MS method and potato apyrase, identifying asiaticoside as one of the apyrase-binding compounds. After isolation of asiaticoside from C. erecta extract, we assessed its in vivo antischistosomal activities against Schistosoma mansoni worms and its in vitro enzymatic apyrase inhibition. Also, molecular docking analysis of asiaticoside against potato apyrase, S. mansoni NTPDases 1 and 2 were performed. Asiaticoside showed a significant in vitro apyrase inhibition and molecular docking studies corroborate with its possible actions in potato apyrase and S. mansoni NTPDases. In mice harboring a patent S. mansoni infection, a single oral dose of asiaticoside (400 mg/kg. p.o.) showed significantly in vivo antischistosomal efficacy, markedly decreasing the total worm load and egg burden, giving support for further exploration of apyrase inhibitors as antischistosomal agents