A correspondence between solution-state dynamics of an individual protein and the sequence and conformational diversity of its family.

Conformational ensembles are increasingly recognized as a useful representation to describe fundamental relationships between protein structure, dynamics and function. Here we present an ensemble of ubiquitin in solution that is created by sampling conformational space without experimental information using "Backrub" motions inspired by alternative conformations observed in sub-Angstrom resolution crystal structures. Backrub-generated structures are then selected to produce an ensemble that optimizes agreement with nuclear magnetic resonance (NMR) Residual Dipolar Couplings (RDCs). Using this ensemble, we probe two proposed relationships between properties of protein ensembles: (i) a link between native-state dynamics and the conformational heterogeneity observed in crystal structures, and (ii) a relation between dynamics of an individual protein and the conformational variability explored by its natural family. We show that the Backrub motional mechanism can simultaneously explore protein native-state dynamics measured by RDCs, encompass the conformational variability present in ubiquitin complex structures and facilitate sampling of conformational and sequence variability matching those occurring in the ubiquitin protein family. Our results thus support an overall relation between protein dynamics and conformational changes enabling sequence changes in evolution. More practically, the presented method can be applied to improve protein design predictions by accounting for intrinsic native-state dynamics

Accessing ns–μs side chain dynamics in ubiquitin with methyl RDCs

This study presents the first application of the model-free analysis (MFA) (Meiler in J Am Chem Soc 123:6098–6107, 2001; Lakomek in J Biomol NMR 34:101–115, 2006) to methyl group RDCs measured in 13 different alignment media in order to describe their supra-τc dynamics in ubiquitin. Our results indicate that methyl groups vary from rigid to very mobile with good correlation to residue type, distance to backbone and solvent exposure, and that considerable additional dynamics are effective at rates slower than the correlation time τc. In fact, the average amplitude of motion expressed in terms of order parameters S2 associated with the supra-τc window brings evidence to the existence of fluctuations contributing as much additional mobility as those already present in the faster ps-ns time scale measured from relaxation data. Comparison to previous results on ubiquitin demonstrates that the RDC-derived order parameters are dominated both by rotameric interconversions and faster libration-type motions around equilibrium positions. They match best with those derived from a combined J-coupling and residual dipolar coupling approach (Chou in J Am Chem Soc 125:8959–8966, 2003) taking backbone motion into account. In order to appreciate the dynamic scale of side chains over the entire protein, the methyl group order parameters are compared to existing dynamic ensembles of ubiquitin. Of those recently published, the broadest one, namely the EROS ensemble (Lange in Science 320:1471–1475, 2008), fits the collection of methyl group order parameters presented here best. Last, we used the MFA-derived averaged spherical harmonics to perform highly-parameterized rotameric searches of the side chains conformation and find expanded rotamer distributions with excellent fit to our data. These rotamer distributions suggest the presence of concerted motions along the side chains

Neue Methoden in der NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der Dynamik von Proteinen

Wesentlicher Inhalt dieser Doktorarbeit ist die Untersuchung der inneren Dynamik von Proteinen in einem Zeitfenster langsamer als die rotatorische Korrelationszeit tau_c (im Bereich von wenigen Nanosekunden) und schneller als ca. 50 Mikrosekunden (Supra-tau_c- Zeitfenster). Dieser Zeitbereich ist für Relaxationsmethoden der kernmagnetischen Resonanz (NMR) nicht zugänglich. Für die Funktion wichtige Proteindynamik in diesem Zeitbereich blieb daher bislang unerforscht. Mit Hilfe von Residualen Dipolaren Kopplungen (RDCs) in der NMR-Spektroskopie konnte dieser bislang verborgene Zeitbereich zugänglich gemacht werden. Als Modellsystem wurde Ubiquitin verwendet, ein 8.5 kDa großes Protein, das in viele regulatorische Prozesse in der Zelle involviert ist, z.B. im Abbauprozess von Proteinen.Während dieser Doktorarbeit wurde die experimentelle Basis der RDCs von NH Amidgruppen im Proteinrückgrat deutlich ausgebaut. Die experimentellen Grundlagen basieren nun auf NH RDC Datensätzen von Präzisionsmessungen in insgesamt 36 verschiedenen Orientierungsmedien. Das ist die breiteste und homogenste zur Zeit verfügbare Datensammlung. Aus den RDCs kann mit Hilfe der sogenannten RDC-basierten Modell-freien Analyse Information über Proteindynamik extrahiert werden. Dieses Analyseverfahren wurde ursprünglich von Griesinger und Mitarbeitern entwickelt und basiert auf der Messung von fünf linear unabhängigen Orientierungstensoren in mindestens fünf verschiedenen Orientierungsmedien. Unter Zuhilfenahme einer hochaufgelösten Struktur zur Berechnung der Orientierungstensoren zu den dazugehörigen RDC Datensätzen, kann damit strukturelle und dynamische Information abgeleitet werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die RDC-basierte Modell-freie Analyse mathematisch rigoros reevaluiert und der Algorithmus erheblich optimiert, z.B. im Hinblick auf die Ausfilterung experimentellen Rauschens. Mit Hilfe des neuen Analyse -Verfahrens konnten RDC-basierte Ordnungsparameter S2rdc(NH) mit bislang unerreichter Genauigkeit bestimmt werden. Diese S2rdc(NH) Ordnungsparameter machen neue, bislang unentdeckte Bewegungsmodi von Ubiquitin im Supra-tau_c-Zeitbereich sichtbar. Geladene und polare Aminosäuren zeigen eine höhere Beweglichkeit der Amidgruppen als Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten. Den Ergebnissen unserer Analyse zufolge liegt eine Korrelation zwischen Seitenketten-Orientierung und der Beweglichkeit des Proteinrückgrates vor. Aminosäuren mit Seitenketten, die der Lösung zugewandt sind, erscheinen im Proteinrückgrat beweglicher als Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten. Diese Beobachtung zeigte sich als alternierendes Muster von S2rdc(NH) Ordnungsparametern im beta-Faltblatt und stellte das bisherige Bild eines verhältnismäßig starren Proteinrückgrates in Frage, das nicht an die Dynamik der Seitenketten gekoppelt ist.Um von der Genauigkeit des Strukturmodells, das bei der Berechnung des Orientierungstensors benutzt wird, unabhängig zu werden, wurde die Selbst-Consistente RDC-basierte Model-freie Analyse (SCRM) entwickelt. Dieses Verfahren liefert RDC-basierte Ordnungsparameter und dynamisch gemittelte NH-Vektor-Orientierungen, unabhängig von den Details der Struktur, die zur Berechnung des Orientierungstensors herangezogen wird. Das SCRM-Verfahren untermauert das Vorhandensein von Bewegung langsamer als die Korrelationszeit tau_c. Der Einschluss des Supra-tau_c-Zeitbereichs vergrößert die mittlere Amplitude der Bewegung gegenüber dem Sub-tau_c-Zeitbereich um 34%.Im weiteren konnte ein RDC-basiertes Struktur-Ensemble von Ubiquitin entwickelt werden. Im Gegensatz zu bisherigen Ensembles, die auf Relaxationsdaten basieren und damit nur Bewegung schneller als die Korrelationszeit tau_c berücksichtigen, schliesst das RDC-basierte Struktur-Ensemble auch Dynamik im Mikrosekunden Bereich mit ein. Dieses neu entwickelte Ensemble deckt die gesamte strukturelle Heterogenität von Ubiquitin ab, die in verschiedenen Kristallstrukturen von Ubiquitin beobachtet wird, wenn dieses im Komplex an andere Proteine gebunden ist. Daraus schliessen wir, dass die molekulare Erkennung durch Ubiquitin über Konformations-Selektion erfolgt. Demzufolge liegen alle Konformationen von Ubiquitin schon in freier Lösung vor und werden nicht erst durch den Bindungspartner induziert

Micelles, Bicelles, and Nanodiscs: Comparing the Impact of Membrane Mimetics on Membrane Protein Backbone Dynamics

Detergents are often used to investigate the structure and dynamics of membrane proteins. Whereas the structural integrity seems to be preserved in detergents for many membrane proteins, their functional activity is frequently compromised, but can be restored in a lipid environment. Herein we show with per-residue resolution that while OmpX forms a stable β-barrel in DPC detergent micelles, DHPC/DMPC bicelles, and DMPC nanodiscs, the pico- to nanosecond and micro- to millisecond motions differ substantially between the detergent and lipid environment. In particular for the β-strands, there is pronounced dynamic variability in the lipid environment, which appears to be suppressed in micelles. This unexpected complex and membrane-mimetic-dependent dynamic behavior indicates that the frequent loss of membrane protein activity in detergents might be related to reduced internal dynamics and that membrane protein activity correlates with lipid flexibility

15N transverse relaxation measurements for the characterization of µs–ms dynamics are deteriorated by the deuterium isotope effect on 15N resulting from solvent exchange

ISSN:0925-2738ISSN:1573-500

Structural dynamics and transient lipid binding of synaptobrevin-2 tune SNARE assembly and membrane fusion

Intrinsically disordered proteins (IDPs) and their conformational transitions play an important role in neurotransmitter release at the neuronal synapse. Here, the SNARE proteins are essential by forming the SNARE complex that drives vesicular membrane fusion. While it is widely accepted that the SNARE proteins are intrinsically disordered in their monomeric prefusion form, important mechanistic aspects of this prefusion conformation and its lipid interactions, before forming the SNARE complex, are not fully understood at the molecular level and remain controversial. Here, by a combination of NMR and fluorescence spectroscopy methods, we find that vesicular synaptobrevin-2 (syb-2) in its monomeric prefusion conformation shows high flexibility, characteristic for an IDP, but also a high dynamic range and increasing rigidity from the N to C terminus. The gradual increase in rigidity correlates with an increase in lipid binding affinity from the N to C terminus. It could also explain the increased rate for C-terminal SNARE zippering, known to be faster than N-terminal SNARE zippering. Also, the syb-2 SNARE motif and, in particular, the linker domain show transient and weak membrane binding, characterized by a high off-rate and low (millimolar) affinity. The transient membrane binding of syb-2 may compensate for the repulsive forces between the two membranes and/or the SNARE motifs and the membranes, helping to destabilize the hydrophilic-hydrophobic boundary in the bilayer. Therefore, we propose that optimum flexibility and membrane binding of syb-2 regulate SNARE assembly and minimize repulsive forces during membrane fusion.ISSN:0027-8424ISSN:1091-649

Proton-Detected NMR Spectroscopy of Nanodisc-Embedded Membrane Proteins: MAS Solid-State vs Solution-State Methods

The structural and dynamical characterization of membrane proteins in a lipid bilayer at physiological pH and temperature and free of crystal constraints is crucial for the elucidation of a structure/dynamics-activity relationship. Toward this aim, we explore here the properties of the outer-membrane protein OmpX embedded in lipid bilayer nanodiscs using proton-detected magic angle spinning (MAS) solid-state NMR at 60 and 110 kHz. [; 1; H,; 15; N]-correlation spectra overlay well with the corresponding solution-state NMR spectra. Line widths as well as line intensities in solid and solution both depend critically on the sample temperature and, in particular, on the crossing of the lipid phase transition temperature. MAS (110 kHz) experiments yield well-resolved NMR spectra also for fully protonated OmpX and both below and above the lipid phase transition temperature

Microsecond Dynamics in Ubiquitin Probed by Solid-State N-15 NMR Spectroscopy R-1 rho Relaxation Experiments under Fast MAS (60-110 kHz)

ISSN:0947-6539ISSN:1521-376

Intrinsic Disorder of the Neuronal SNARE Protein SNAP25a in its Pre-fusion Conformation

The neuronal Q-SNARE protein SNAP25a (isoform 2) forms part of the SNARE complex eliciting synaptic vesicle fusion during neuronal exocytosis. While the post-fusion cis-SNARE complex has been studied extensively, little is known about the pre-fusion conformation of SNAP25a. Here we analyze SNAP25a in its monomeric pre-fusion conformation by NMR spectroscopy and find it intrinsically disordered and highly dynamic. While from residue L35 onwards, intrinsic disorder dominates (including the second SNARE motif, SN2), region A5 to L35 (comprising the N-terminus of the first SNARE motif, SN1) shows strong α-helical propensity. Our findings suggest that the N-terminus of SN1 may act as a nucleation site for SNARE acceptor complex assembly. As a side note, our result of an intrinsic disorder of SNAP25 contrasts with a recent prediction of AlphaFold2 that predicted SN1 and SN2 to be entirely α-helical with high confidence