Two alternatively-spliced human nebulin isoforms with either exon 143 or exon 144 and their developmental regulation

Nebulin is a very large protein required for assembly of the contractile machinery in muscle. Mutations in the nebulin gene NEB are a common cause of nemaline myopathy. Nebulin mRNA is alternatively-spliced so that each mRNA contains either exon 143 or exon 144. We have produced monoclonal antibodies specific for the regions of nebulin encoded by these two exons, enabling analysis of expression of isoforms at the protein level for the first time. All antibodies recognized a protein of the expected size (600-900 kD) and stained cross-striations of sarcomeres in muscle sections. Expression of exon 143 is developmentally-regulated since newly-formed myotubes in cell culture expressed nebulin with exon 144 only; this was confirmed at the mRNA level by qPCR. In fetal muscle, nebulin with exon 143 was expressed in some myotubes by 12-weeks of gestation and strongly-expressed in most myotubes by 17-weeks. In mature human muscle, the exon 144 antibody stained all fibres, but the exon 143 antibody staining varied from very strong in some fibres to almost-undetectable in other fibres. The results show that nebulin containing exon 144 is the default isoform early in myogenesis, while regulated expression of nebulin containing exon 143 occurs at later stages of muscle development.Peer reviewe

Nebulin interactions with actin and tropomyosin are altered by disease-causing mutations

Background: Nemaline myopathy (NM) is a rare genetic muscle disorder, but one of the most common among the congenital myopathies. NM is caused by mutations in at least nine genes: Nebulin (NEB), alpha-actin (ACTA1), alpha-tropomyosin (TPM3), beta-tropomyosin (TPM2), troponin T (TNNT1), cofilin-2 (CFL2), Kelch repeat and BTB (POZ) domain-containing 13 (KBTBD13), and Kelch-like family members 40 and 41 (KLHL40 and KLHL41). Nebulin is a giant (600 to 900 kDa) filamentous protein constituting part of the skeletal muscle thin filament. Around 90% of the primary structure of nebulin is composed of approximately 35-residue alpha-helical domains, which form super repeats that bind actin with high affinity. Each super repeat has been proposed to harbor one tropomyosin-binding site. Methods: We produced four wild-type (WT) nebulin super repeats (S9, S14, S18, and S22), 283 to 347 amino acids long, and five corresponding repeats with a patient mutation included: three missense mutations (p.Glu2431Lys, p.Ser6366Ile, and p.Thr7382Pro) and two in-frame deletions (p.Arg2478_Asp2512del and p.Val3924_Asn3929del). We performed F-actin and tropomyosin-binding experiments for the nebulin super repeats, using co-sedimentation and GST (glutathione-S-transferase) pull-down assays. We also used the GST pull-down assay to test the affinity of WT nebulin super repeats for WT alpha- and beta-tropomyosin, and for beta-tropomyosin with six patient mutations: p.Lys7del, p. Glu41Lys, p.Lys49del, p.Glu117Lys, p.Glu139del and p.Gln147Pro. Results: WT nebulin was shown to interact with actin and tropomyosin. Both the nebulin super repeats containing the p.Glu2431Lys mutation and nebulin super repeats lacking exon 55 (p.Arg2478_Asp2512del) showed weak affinity for F-actin compared with WT fragments. Super repeats containing the p.Ser6366Ile mutation showed strong affinity for actin. When tested for tropomyosin affinity, super repeats containing the p.Glu2431Lys mutation showed stronger binding than WT proteins to tropomyosin, and the super repeat containing the p.Thr7382Pro mutation showed weaker binding than WT proteins to tropomyosin. Super repeats containing the deletion p. Val3924_Asn3929del showed similar affinity for actin and tropomyosin as that seen with WT super repeats. Of the tropomyosin mutations, only p.Glu41Lys showed weaker affinity for nebulin (super repeat 18). Conclusions: We demonstrate for the first time the existence of direct tropomyosin-nebulin interactions in vitro, and show that nebulin interactions with actin and tropomyosin are altered by disease-causing mutations in nebulin and tropomyosin.Peer reviewe

Dominantly inherited distal nemaline/cap myopathy caused by a large deletion in the nebulin gene

We report the first family with a dominantly inherited mutation of the nebulin gene (NEB). This 100kb in-frame deletion encompasses NEB exons 14-89, causing distal nemaline/cap myopathy in a three-generation family. It is the largest deletion characterized in NEB hitherto. The mutated allele was shown to be expressed at the mRNA level and furthermore, for the first time, a deletion was shown to cause the production of a smaller mutant nebulin protein. Thus, we suggest that this novel mutant nebulin protein has a dominant-negative effect, explaining the first documented dominant inheritance of nebulin-caused myopathy. The index patient, a young man, was more severely affected than his mother and grandmother. His first symptom was foot drop at the age of three, followed by distal muscle atrophy, slight hypomimia, high-arched palate, and weakness of the neck and elbow flexors, hands, tibialis anterior and toe extensors. Muscle biopsies showed myopathic features with type 1 fibre predominance in the index patient and nemaline bodies and cap-like structures in biopsies from his mother and grandmother. The muscle biopsy findings constitute a further example of nemaline bodies and cap-like structures being part of the same spectrum of pathological changes. (C) 2019 Elsevier B.V. All rights reserved.Peer reviewe

Myosin ATPase inhibition fails to rescue the metabolically dysregulated proteome of nebulin-deficient muscle

Abstract: Nemaline myopathy (NM) is a genetic muscle disease, primarily caused by mutations in the NEB gene (NEB-NM) and with muscle myosin dysfunction as a major molecular pathogenic mechanism. Recently, we have observed that the myosin biochemical super-relaxed state was significantly impaired in NEB-NM, inducing an aberrant increase in ATP consumption and remodelling of the energy proteome in diseased muscle fibres. Because the small-molecule Mavacamten is known to promote the myosin super-relaxed state and reduce the ATP demand, we tested its potency in the context of NEB-NM. We first conducted in vitro experiments in isolated single myofibres from patients and found that Mavacamten successfully reversed the myosin ATP overconsumption. Following this, we assessed its short-term in vivo effects using the conditional nebulin knockout (cNeb KO) mouse model and subsequently performing global proteomics profiling in dissected soleus myofibres. After a 4 week treatment period, we observed a remodelling of a large number of proteins in both cNeb KO mice and their wild-type siblings. Nevertheless, these changes were not related to the energy proteome, indicating that short-term Mavacamten treatment is not sufficient to properly counterbalance the metabolically dysregulated proteome of cNeb KO mice. Taken together, our findings emphasize Mavacamten potency in vitro but challenge its short-term efficacy in vivo. (Figure presented.). Key points: No cure exists for nemaline myopathy, a type of genetic skeletal muscle disease mainly derived from mutations in genes encoding myofilament proteins. Applying Mavacamten, a small molecule directly targeting the myofilaments, to isolated membrane-permeabilized muscle fibres from human patients restored myosin energetic disturbances. Treating a mouse model of nemaline myopathy in vivo with Mavacamten for 4 weeks, remodelled the skeletal muscle fibre proteome without any noticeable effects on energetic proteins. Short-term Mavacamten treatment may not be sufficient to reverse the muscle phenotype in nemaline myopathy.Peer reviewe

NEB mutations disrupt the super-relaxed state of myosin and remodel the muscle metabolic proteome in nemaline myopathy

Nemaline myopathy (NM) is one of the most common non-dystrophic genetic muscle disorders. NM is often associated with mutations in the NEB gene. Even though the exact NEB-NM pathophysiological mechanisms remain unclear, histological analyses of patients' muscle biopsies often reveal unexplained accumulation of glycogen and abnormally shaped mitochondria. Hence, the aim of the present study was to define the exact molecular and cellular cascade of events that would lead to potential changes in muscle energetics in NEB-NM. For that, we applied a wide range of biophysical and cell biology assays on skeletal muscle fibres from NM patients as well as untargeted proteomics analyses on isolated myofibres from a muscle-specific nebulin-deficient mouse model. Unexpectedly, we found that the myosin stabilizing conformational state, known as super-relaxed state, was significantly impaired, inducing an increase in the energy (ATP) consumption of resting muscle fibres from NEB-NM patients when compared with controls or with other forms of genetic/rare, acquired NM. This destabilization of the myosin super-relaxed state had dynamic consequences as we observed a remodeling of the metabolic proteome in muscle fibres from nebulin-deficient mice. Altogether, our findings explain some of the hitherto obscure hallmarks of NM, including the appearance of abnormal energy proteins and suggest potential beneficial effects of drugs targeting myosin activity/conformations for NEB-NM.Peer reviewe

Nebulin nemaline myopathy recapitulated in a compound heterozygous mouse model with both a missense and a nonsense mutation in Neb

Nemaline myopathy (NM) caused by mutations in the gene encoding nebulin (NEB) accounts for at least 50% of all NM cases worldwide, representing a significant disease burden. Most NEB-NM patients have autosomal recessive disease due to a compound heterozygous genotype. Of the few murine models developed for NEB-NM, most are Neb knockout models rather than harbouring Neb mutations. Additionally, some models have a very severe phenotype that limits their application for evaluating disease progression and potential therapies. No existing murine models possess compound heterozygous Neb mutations that reflect the genotype and resulting phenotype present in most patients. We aimed to develop a murine model that more closely matched the underlying genetics of NEB-NM, which could assist elucidation of the pathogenetic mechanisms underlying the disease. Here, we have characterised a mouse strain with compound heterozygous Neb mutations; one missense (p.Tyr2303His), affecting a conserved actin-binding site and one nonsense mutation (p.Tyr935*), introducing a premature stop codon early in the protein. Our studies reveal that this compound heterozygous model, Neb(Y2303H, Y935X), has striking skeletal muscle pathology including nemaline bodies. In vitro whole muscle and single myofibre physiology studies also demonstrate functional perturbations. However, no reduction in lifespan was noted. Therefore, Neb(Y2303H,Y935X) mice recapitulate human NEB-NM and are a much needed addition to the NEB-NM mouse model collection. The moderate phenotype also makes this an appropriate model for studying NEB-NM pathogenesis, and could potentially be suitable for testing therapeutic applications.Peer reviewe

Nebulin nemaline myopathy recapitulated in a compound heterozygous mouse model with both a missense and a nonsense mutation in Neb

Nemaline myopathy (NM) caused by mutations in the gene encoding nebulin (NEB) accounts for at least 50% of all NM cases worldwide, representing a significant disease burden. Most NEB-NM patients have autosomal recessive disease due to a compound heterozygous genotype. Of the few murine models developed for NEB-NM, most are Neb knockout models rather than harbouring Neb mutations. Additionally, some models have a very severe phenotype that limits their application for evaluating disease progression and potential therapies. No existing murine models possess compound heterozygous Neb mutations that reflect the genotype and resulting phenotype present in most patients. We aimed to develop a murine model that more closely matched the underlying genetics of NEB-NM, which could assist elucidation of the pathogenetic mechanisms underlying the disease. Here, we have characterised a mouse strain with compound heterozygous Neb mutations; one missense (p.Tyr2303His), affecting a conserved actin-binding site and one nonsense mutation (p.Tyr935*), introducing a premature stop codon early in the protein. Our studies reveal that this compound heterozygous model, Neb(Y2303H, Y935X), has striking skeletal muscle pathology including nemaline bodies. In vitro whole muscle and single myofibre physiology studies also demonstrate functional perturbations. However, no reduction in lifespan was noted. Therefore, Neb(Y2303H,Y935X) mice recapitulate human NEB-NM and are a much needed addition to the NEB-NM mouse model collection. The moderate phenotype also makes this an appropriate model for studying NEB-NM pathogenesis, and could potentially be suitable for testing therapeutic applications.Peer reviewe

Ilmastonmuutoksen ja sään ääri-ilmiöiden vaikutukset luontoon ja luonnonvaratalouteen : Synteesiraportti

Ilmastonmuutoksen vaikutukset koskevat kaikkia luonnonvarataloutemme sektoreita. Suomen ilmasto on lämmennyt merkittävästi tunnetun mittaushistorian aikana. Lämpenemisellä on merkittäviä vaikutuksia luontoon ja siitä riippuvaan talouteen. Merkittäviä tapahtuneita muutoksia ovat mm. kasvillisuusvyöhykkeiden siirtyminen pohjoisemmaksi, kasvukauden pidentyminen, vuosittaisen lämpösummakertymän kasvaminen sekä jää- ja lumipeitteisen ja routaisen ajan lyhentyminen. Lämpenemisen lisäksi ilmastonmuutos lisää sään ääri-ilmiöitä kuten kuivuus- ja sadejaksoja. Kuivuus vaikuttaa negatiivisesti mm. puiden kasvuun, lisää niiden alttiutta hyönteistuhoille ja sienitaudeille sekä kasvattaa metsäpalojen riskiä. Samalla se heikentää satotasoja pelloilla merkittävästi ja lisää kastelupainetta mm. vihannestuotannossa. Metsissä kuivuuden lisäksi vaikuttaa mm. roudattoman ja lumettoman ajan lisääntyminen. Puunkorjuu roudattomaan aikaan ei onnistu märillä kohteilla. Lumeton aika lisää metsäkoneiden aiheuttamia korjuuvaurioita, jotka toimivat tartunta-alustoina sienitaudeille. Roudattomassa maassa puut myös kaatuvat helpommin talven aikana. Lämpötilojen kohoaminen kasvattaa tuhohyönteiskantoja ja vie tuhoriskiä aiempaa pohjoisemmaksi. Puutavaran varastointi vaatii enemmän aktiivisuutta ja tarkkuutta, sillä puutavarapinot toimivat kesäaikaan tuhohyönteisten lisääntymisalustoina. Kuivuus kasvattaa tautipainetta myös taimitarhoilla sekä lisää tarvetta kastelulle. Maltillinen lämpeneminen ja pidentyvä kasvukausi kuitenkin lisäävät puuston kasvua ja edesauttavat jalojen lehtipuiden leviämistä pohjoisemmaksi. Vesistöissä lisääntyvät hellejaksot yhdistettynä rehevöitymisen aiheuttamaan hapen vähyyteen ovat riski luonnon kalakannoille ja kasvatettaville kaloille. Lisääntyvä sateisuus ja valunta aiheuttavat haitallisia vaikutuksia kutualueilla. Niitä voidaan vähentää kiinnittämällä huomiota valuma-alueiden kunnostamiseen, joka parantaa ravinteiden ja humuksen pidätyskykyä. Jääpeitteisyyden muutokset aiheuttavat vaikeuksia perinteiselle jäältä tapahtuvalle talvikalastukselle. Entistä tarkempi kalastuskauden aikainen säätely voi tulla tarpeeseen hellejaksojen aikana. Kalankasvatuksen teknologiset ratkaisut voivat auttaa ilmastonmuutokseen sopeutumisessa. Peltoviljely on altis vallitseville säille, joiden haitoilta suojautuminen edellyttää monipuolisten sopeutumistoimien käyttöönottoa. Kylvöt ovat aikaistuneet parilla viikolla, mikä ei kuitenkaan ole heijastunut korjuuaikoihin. Kasvukauden pidentyminen on mahdollistanut viljelykasvivalikoiman monipuolistamisen kuten myöhäisempien ja satoisampien lajikkeiden käyttöönoton. Ennusteet kasvukauden aikaisista sademäärän muutoksista vaihtelevat lisääntyvästä vähenevään sadantaan. Äärisäiden, erityisesti kuivuuden, haittoja voidaan kuitenkin vähentää ennakoivin ja pitkäjänteisyyttä edellyttävin viljelytoimin. Tällaisia toimia ovat muun muassa monipuolistuva ja alueellisesti laajeneva viljelykasvilajisto sekä maanpeite- ja välikasvien käyttö. Puutarhatuotannossa kasvien menestyminen Suomen talvessa paranee, sillä monivuotisten kasvien pakkasvaurioiden riski pienenee. Monivuotisten puutarhakasvien lajikkeiden menestymisvyöhykkeet siirtyvät pohjoisemmaksi. Samalla Suomessa menestyvien lajikkeiden määrä lisääntyy. Tuhohyönteisten, rikkakasvien, vieraslajien ja kasvitautien määrät voivat kasvaa. Kuivuusjaksot voivat lisätä kastelun tarvetta mm. avomaan vihannestuotannossa. Riista- ja metsälajistoon vaikuttavat mm. lumen määrään ja lumisen ajan pituus, routa, sateisuus, talvien ankaruus, jäiden sulamisajankohta sekä veden laatu. Valkoiseen suojaväriin vaihtavat lajit kärsivät lumen puutteesta, koska se tekee niistä helppoja ja näkyviä saaliseläimiä. Norpat ja hylkeet kärsivät huonoista jääolosuhteista, sillä niille olisi optimaalisinta synnyttää poikasensa jäälle. Yleisesti lajien välinen kilpailu voi lisääntyä, sillä eteläiset lajit, tulokaslajit ja vieraslajit lisääntyvät ja leviävät pohjoisemmaksi. Tämä raportti tiivistää tutkitun tiedon pohjalta tunnettuja ilmastonmuutoksen ja sään ääri-ilmiöiden vaikutuksia luontoomme ja luonnonvaratalouteemme. Tavoite on avata ilmiöitä ja niiden vaikutuksia helposti ymmärrettävässä muodossa, samalla tarjoten runsaasti taustalla olevaa tutkimuskirjallisuutta. Asiasanat: ilmastonmuutos, sopeutuminen, metsät, riista, vesiviljely, kalakannat, kuivuus, maatalous, puutarhatuotanto, sään ääri-ilmiöt, valintajalostu

Ostolaskuprosessin kehittäminen assistenttien näkökulmasta

Tässä opinnäytetyössä keskitytään toimeksiantajana toimivan yritys X:n ostolaskuprosessin kehittämiseen assistenttien näkökulmasta. Assistenteilla on suuri rooli ostolaskujen käsittelyssä, joten on aiheellista tarkastella, mitkä asiat he kokevat haasteelliseksi, missä asioissa he kokevat tarvitsevansa enemmän tukea ja apua ja mitä ideoita heillä on ostolaskuprosessin kehittämiseksi. Opinnäytetyö on tehty marraskuun 2017 ja maaliskuun 2018 välillä. Työn teoriaosuudessa keskitytään sähköiseen taloushallintoon kokonaisuutena, ja ostolaskuprosessi -luvussa käsitellään ostolaskuprosessia laajemmin. Työ toteutettiin kvalitatiivisena tutkimuksena. Tutkimus toteutettiin haastatteluina, jotka suoritettiin kolmen hengen ryhmissä etukäteen valittujen assistenttien kanssa. Haastattelut pidettiin tammikuun 2018 alussa. Tavoitteena oli löytää ongelmakohdat ostolaskuprosessissa ja pyrkiä löytämään niihin ratkaisut, jotka helpottavat assistenttien työtä ostolaskujen käsittelyssä. Haastatteluista saatiin poimittua monipuoliset tutkimustulokset. Assistentit kokivat haastaviksi muun muassa tiliöinnin ja valuuttalaskut. Tutkimustulosten pohjalta saatiin muodostettua kehitysehdotukset. Työn tulokset kertovat sen, miten ostolaskuprosessia voidaan kehittää entistä paremmaksi, jotta assistentit voisivat toimia ostolaskujen parissa varmemmin