On the interpretation of decay-associated fluorescence spectra in proteins

Calculating decay-associated spectra (DAS) is a common mode of analyzing complex fluorescence decay in proteins. Unfortunately, these spectra are attributed almost exclusively to certain species in the population of macromolecules (retainers), often without sufficient evidence. An alternative explanation of decay heterogeneity, based on structural relaxation., was believed to require a negative DAS component. Here we demonstrate that dipolar relaxation of the indole molecule, lacking any rotameric forms, doesn't always result in negative pre-exponential amplitude. We conclude that the shape of DAS alone is not sufficient to differentiate among various causes of heterogeneity of tryptophan fluorescence decay in proteins.Расчет спектров, ассоциированных с затуханием (САЗ), явля­ется обычным путем анализа сложного затухания флюорес­ценции в белках. К сожалению, эти спектры почти исключи­тельно относят к определенным видам в популяции молекул (ротамеров), часто без достаточных оснований Считалось, что альтернативное объяснение гетерогенности затухания, связанное со структурной релаксацией, требует отрицатель­ной компоненты САЗ. В данной работе мы демонстрируем, что дипольная релаксация молекулы индола, лишенной каких-либо ротамерных форм, не всегда приводит к отрицательным при-экспоненциальным амплитудам. Мы делаем вывод о том, что форма САЗ сама по себе недостаточна, чтобы опреде­лить среди других причину гетерогенности затухания триптофановой флюоресценции в белках.Обрахунок спектрів, асоційованих із затуханням (САЗ), є звичайним шляхом аналізу складного затухання флюоресценції в білках. На жаль, ці спектри майже виключно відносять до певних видів у популяції молекул (ротамерів), часто без достатніх на те підстав. Вважалося, що альтернативне пояснення гетерогенності затухання, пов'язане зі структур­ною релаксацією, потребує негативної компоненти САЗ. У цій роботі ми демонструємо, що дипольна релаксація молекули індолу, позбавленої будь-яких ротамерних форм, не завжди призводить до негативних при-експоненціальних амплітуд. Ми робимо висновок стосовно того, що форма САЗ сама по собі не є достатньою, щоб вирізнити серед інших причину гетерогенності затухання триптофанової флюоресценції в білках

Characteristic structural features of indolicidin: effects of the cis-trans isomerism on its conformation

Indolicidin is an antimicrobial peptide showing a broad spectrum of antibacterial and antifungal activities, and according to the cis-trans isomerism of three Xaa-Pro peptide bonds, eight different stereoisomers could be distinguished for this peptide. As the cis-trans isomerism about the Xaa-Pro peptide bonds was not considered in previous studies, the structural features of distinct stereoisomeric forms were not characterized in detail, so far. In this theoretical study, the influences of cis-trans isomerism on the conformation of indolicidin were investigated, as well as the typical structural properties of each stereoisomer were determined, focusing on the secondary structures and intramolecular interactions. Based on the results derived from the molecular dynamics simulations, it could be concluded that the eight different stereoisomeric forms of indolicidin adopted characteristic conformational features. Nevertheless, the appearance of various turn structures and intramolecular interactions proved to be dependent on the cis or trans nature of Xaa-Pro peptide bonds, indicating the relevant role of Pro amino acids in determining the three-dimensional structure of this peptide

Insertion intermediate of annexin B12 is prone to aggregation on membrane interfaces

Annexin B12 (ANX) is known to insert across the lipid bilayer at acidic pH in the absence of Ca²⁺ and to form a pore-like structure consisting of several transmembrane helices, most of which are unknown. Our previous studies demonstrate that the insertion proceeds via an interfacial refolded intermediate state, which can be stabilized by anionic lipids. Energy transfer measurements in a mixture of donor- and acceptor-labeled ANX indicate that this interfacial intermediate, unlike the final transmembrane conformation, is prone to aggregation. Such aggregation of a non-inserted ANX may have implications for a possible general mechanism of misfolding of membrane proteins.Відомо, що анексин В12 (ANX) вбудовується в ліпідний бішар при кислих рН у відсутності Са²⁺ та утворює пороподібну структуру, яка складається з кількох трансмембранних спіралей, більшість з яких невідома. Наші попередні дослідження показали, що вбудовування відбувається за участі поверхневого фолдингового інтермедіату, що може бути стабілізованим аніонними ліпідами. Виміри переносу енергії в суміші ANX, міченого донором та акцептором, вказують на те, що цей поверхневий інтермедіат, але не кінцева трансмембранна конформація, є схильний до агрегації. Ця агрегація невбудованого ANX може мати наслідки для можливого загального механізму місфолдингу мембранних білківИзвестно, что аннексин В12 (ANX) встраивается в липидный бислой при кислых рН в отсутствие Са²⁺ и образует пороподобную структуру, состоящую из нескольких трансмембранных спиралей, большинство из которых неизвестно. Наши предшествующие исследования показали, что встраивание происходит посредством поверхностного фолдингового интермедиата, стабилизируемого анионными липидами. Измерения переноса энергии в смеси ANX, меченного донором и акцептором, указывают на то, что этот поверхностный интермедиат, но не конечная трансмембранная конформация, подвержден агрегации. Такая агрегация невстроенного ANX может иметь последствия для возможного общего механизма мисфолдинга мембранных белков

Membrane Partitioning: “Classical” and “Nonclassical” Hydrophobic Effects

The free energy of transfer of nonpolar solutes from water to lipid bilayers is often dominated by a large negative enthalpy rather than the large positive entropy expected from the hydrophobic effect. This common observation has led to the idea that membrane partitioning is driven by the “nonclassical” hydrophobic effect. We examined this phenomenon by characterizing the partitioning of the well-studied peptide melittin using isothermal titration calorimetry (ITC) and circular dichroism (CD). We studied the temperature dependence of the entropic (−TΔS) and enthalpic (ΔH) components of free energy (ΔG) of partitioning of melittin into lipid membranes made of various mixtures of zwitterionic and anionic lipids. We found significant variations of the entropic and enthalpic components with temperature, lipid composition and vesicle size but only small changes in ΔG (entropy–enthalpy compensation). The heat capacity associated with partitioning had a large negative value of about −0.5 kcal mol−1 K−1. This hallmark of the hydrophobic effect was found to be independent of lipid composition. The measured heat capacity values were used to calculate the hydrophobic-effect free energy ΔGhΦ, which we found to dominate melittin partitioning regardless of lipid composition. In the case of anionic membranes, additional free energy comes from coulombic attraction, which is characterized by a small effective peptide charge due to the lack of additivity of hydrophobic and electrostatic interactions in membrane interfaces [Ladokhin and White J Mol Biol 309:543–552, 2001]. Our results suggest that there is no need for a special effect—the nonclassical hydrophobic effect—to describe partitioning into lipid bilayers

Vibrations and fractional vibrations of rods, plates and Fresnel pseudo-processes

Different initial and boundary value problems for the equation of vibrations of rods (also called Fresnel equation) are solved by exploiting the connection with Brownian motion and the heat equation. The analysis of the fractional version (of order $\nu$) of the Fresnel equation is also performed and, in detail, some specific cases, like $\nu=1/2$, 1/3, 2/3, are analyzed. By means of the fundamental solution of the Fresnel equation, a pseudo-process $F(t)$, $t>0$ with real sign-varying density is constructed and some of its properties examined. The equation of vibrations of plates is considered and the case of circular vibrating disks $C_R$ is investigated by applying the methods of planar orthogonally reflecting Brownian motion within $C_R$. The composition of F with reflecting Brownian motion $B$ yields the law of biquadratic heat equation while the composition of $F$ with the first passage time $T_t$ of $B$ produces a genuine probability law strictly connected with the Cauchy process.Comment: 33 pages,8 figure

Fluorescence tools for studies of membrane protein insertion

The transition of soluble proteins into lipid membranes and their refolding therein is fundamental to numerous physiological and disease processes. In this review, we present the summary of the application of fluorescence spectroscopy for studying posttranslational insertion of membrane proteins into lipid bilayers. Various methods utilizing environment-sensitive probes, FRET, FCS and fluorescent quenching for structural and kinetic characterization of protein-lipid interactions are discussed. We also describe the application of steady-state and time-resolved fluorescence quenching by lipid-attached quenchers to characterize the membrane protein immersion into the lipid bilayer. Finally, we illustrate the use of the entire battery of spectroscopic approaches to characterize structural, kinetic and thermodynamic properties of the pH-triggered insertion/refolding pathway of the diphtheria toxin translocation domain.Перехід розчинних білків до ліпідної мембрани та їх подальша перебудова є фундаментальною ланкою у чисельних фізіологічних та біохімічних процесах. У цьому огляді нами наведено підсумки використання флуоресцентної спектроскопії у дослідженні посттрансляційного вбудовування мембранних білків до ліпідних бішарів. Розглянуто різноманітні методи, які використовують спектральні зонди, чутливі до зовнішнього оточення, ферстерівське резонансне перенесення енергії (ФРПЕ), флуоресцентну кореляційну спектроскопію (ФКС) та гасіння флуоресценції у встановленні структурних та кінетичних характеристик білок-ліпідної взаємодії. Наведено приклади застосування стаціонарного та часо-розділенного гасіння флуоресценції ліпідно-зв’язаними гасниками для дослідження занурення мембранних білків до ліпідного бішару. Наприкінці нами показано комбіноване використання різноманітних спектральних підходів для цілісного вивчення структурних, кінетичних та термодинамічних властивостей рН-індукованої послідовності процесів вбудовування\перебудови транслокаційного домену дифтерійного токсину.Переход растворимых белков в липидную мембрану и их дальнейший рефолдинг является фундаментальной частью во многочисленных физиологических и биохимических процессах. У этом обзоре нами приведено обобщение применения флуоресцентной спектроскопии в изучении посттрансляционного встраивания мембранных белков в липидные бислои. Рассмотрены разнообразные методы, которые используют спектральные зонды, чувствительные к внешнему окружению, ферстеровский резонансный перенос энергии (ФРПЭ), флуоресцентную корреляционную спектроскопию (ФКС) и тушение флуоресценции для установления структурных и кинетических характеристик белок-липидного взаимодействия. Приведены примеры применения стационарного и время-разрешенного тушения флуоресценции липидно-связанными тушителями для изучения погружения мембранных белков в липидный бислой. Подводя итог нами показано комбинированное применение разнообразных спектральных подходов для целостного изучения структурных, кинетических и термодинамических свойств рН-индуцированной последовательности процессов встраивания\рефолдинга транслокационного домена дифтерийного токсина

Structure of the Diphtheria Toxin at Acidic pH: Implications for the Conformational Switching of the Translocation Domain

This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license.Diphtheria toxin, an exotoxin secreted by Corynebacterium that causes disease in humans by inhibiting protein synthesis, enters the cell via receptor-mediated endocytosis. The subsequent endosomal acidification triggers a series of conformational changes, resulting in the refolding and membrane insertion of the translocation (T-)domain and ultimately leading to the translocation of the catalytic domain into the cytoplasm. Here, we use X-ray crystallography along with circular dichroism and fluorescence spectroscopy to gain insight into the mechanism of the early stages of pH-dependent conformational transition. For the first time, we present the high-resolution structure of the diphtheria toxin at a mildly acidic pH (5–6) and compare it to the structure at neutral pH (7). We demonstrate that neither catalytic nor receptor-binding domains change their structure upon this acidification, while the T-domain undergoes a conformational change that results in the unfolding of the TH2–3 helices. Surprisingly, the TH1 helix maintains its conformation in the crystal of the full-length toxin even at pH 5. This contrasts with the evidence from the new and previously published data, obtained by spectroscopic measurements and molecular dynamics computer simulations, which indicate the refolding of TH1 upon the acidification of the isolated T-domain. The overall results imply that the membrane interactions of the T-domain are critical in ensuring the proper conformational changes required for the preparation of the diphtheria toxin for the cellular entry.National Institute of General Medical Sciences (P30 GM110761)Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under contract no. DE-AC02-06CH1135

Using zeta-potential measurements to quantify peptide partition to lipid membranes

© The Author(s) 2011. This article is published with open access at Springerlink.com.Open Access: This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Noncommercial License which permits any noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author(s) and source are credited.Many cellular phenomena occur on the biomembranes. There are plenty of molecules (natural or xenobiotics) that interact directly or partially with the cell membrane. Biomolecules, such as several peptides (e.g., antimicrobial peptides) and proteins, exert their effects at the cell membrane level. This feature makes necessary investigating their interactions with lipids to clarify their mechanisms of action and side effects necessary. The determination of molecular lipid/water partition constants (Kp) is frequently used to quantify the extension of the interaction. The determination of this parameter has been achieved by using different methodologies, such as UV-Vis absorption spectrophotometry, fluorescence spectroscopy and ζ-potential measurements. In this work, we derived and tested a mathematical model to determine the Kp from ζ-potential data. The values obtained with this method were compared with those obtained by fluorescence spectroscopy, which is a regular technique used to quantify the interaction of intrinsically fluorescent peptides with selected biomembrane model systems. Two antimicrobial peptides (BP100 and pepR) were evaluated by this new method. The results obtained by this new methodology show that ζ-potential is a powerful technique to quantify peptide/lipid interactions of a wide variety of charged molecules, overcoming some of the limitations inherent to other techniques, such as the need for fluorescent labeling.This work was partially supported by project PTDC/QUI/ 69937/2006 from Fundação para a Ciência e Tecnologia-Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (FCT-MCTES, Portugal), and by Fundação Calouste Gulbenkian (Portugal). JMF and MMD also thank FCT-MCTES for grants IMM/BT/37-2010 and SFRH/BD/41750/2007, respectively