Application of the SELEX process for the study of guanine quadruplexes

Les séquences riches en guanines, qu’elles soient ADN ou ARN, peuvent former des structures non canoniques à quatre brins appelées quadruplexes de guanines ou G-quadruplexes. Ces structures reposent sur la formation et l’empilement de quartets de guanines ; elles peuvent être trouvées dans de nombreuses régions du génome. Des motifs G-quadruplexes apparaissent fréquemment lors de la sélection d'aptamères par SELEX : on constate un biais dans la proportion de guanines par rapport aux autres nucléotides dans les bases de données regroupant les séquences d'aptamères connus. Nous avons entrepris une analyse systématique, in silico puis in vitro, de motifs aptamères décrits dans la littérature. Nous avons utilisé un algorithme de prédiction actuellement développé au sein du laboratoire dans le but de déterminer quelles sont les séquences susceptibles de former des G-quadruplexes in silico. Afin de vérifier ces prédictions, un test biophysique permettant de cribler rapidement de nombreuses séquences a été mis en place. Nos résultats démontrent que de nombreux aptamères publiés sont susceptibles de se replier en G-quadruplexe. Un autre volet de ce travail concernait la mise en pratique du SELEX avec deux objectifs distincts. Nous avons d'abord effectué une sélection in vitro contre un ligand de G-quadruplexes, afin de préciser quels motifs nucléiques peuvent interagir avec cette molécule. Nous avons réalisé ensuite des expérience de SELEX contre plusieurs G-quadruplexes ADN ou ARN biologiquement pertinents (motif télomérique humain, répétitions minisatellites et séquences présentes dans les UTR de différents ARNm), dans le but d'obtenir des sondes spécifiques de ces conformations.Guanine-rich DNA or RNA sequences can adopt non-canonical structures composed of four strands called guanines quadruplexes or G-quadruplexes. These structures are made by the formation and stacking of guanine quartets; they can be found in various region of the genome. G-quadruplexes motifs are frequently found during the selection of aptamers by the so-called SELEX method: a bias exists in the proportion of guanines in comparison with other nucleotides in a database gathering together known aptamers sequences. We did an in silico then in vitro systematic analysis of aptameric motifs described in the literature. We used a prediction algorithm currently developed in the laboratory to determine which sequences car form G-quadruplexes in silico. In order to check those predictions, a biophysical test allowing to quickly assay a lot of sequences was set up. Our results demonstrate that a lot of published aptamers are able to fold into G-quadruplexes. Another part of this work is related to the use of the SELEX with two different goals. First of all we did an in vitro selection against a G-quadruplexes ligand, in order to tell exactly which nucleic motifs can interact with this molecule. We then carried out SELEX experiments against several DNA or RNA biologically relevant G-quadruplexes (human telomeric motifs, minisatellite repetitions and sequences from UTR of mRNA), with the aim of getting specific probes for these conformations

Application of the SELEX process for the study of guanine quadruplexes

Les séquences riches en guanines, qu’elles soient ADN ou ARN, peuvent former des structures non canoniques à quatre brins appelées quadruplexes de guanines ou G-quadruplexes. Ces structures reposent sur la formation et l’empilement de quartets de guanines ; elles peuvent être trouvées dans de nombreuses régions du génome. Des motifs G-quadruplexes apparaissent fréquemment lors de la sélection d'aptamères par SELEX : on constate un biais dans la proportion de guanines par rapport aux autres nucléotides dans les bases de données regroupant les séquences d'aptamères connus. Nous avons entrepris une analyse systématique, in silico puis in vitro, de motifs aptamères décrits dans la littérature. Nous avons utilisé un algorithme de prédiction actuellement développé au sein du laboratoire dans le but de déterminer quelles sont les séquences susceptibles de former des G-quadruplexes in silico. Afin de vérifier ces prédictions, un test biophysique permettant de cribler rapidement de nombreuses séquences a été mis en place. Nos résultats démontrent que de nombreux aptamères publiés sont susceptibles de se replier en G-quadruplexe. Un autre volet de ce travail concernait la mise en pratique du SELEX avec deux objectifs distincts. Nous avons d'abord effectué une sélection in vitro contre un ligand de G-quadruplexes, afin de préciser quels motifs nucléiques peuvent interagir avec cette molécule. Nous avons réalisé ensuite des expérience de SELEX contre plusieurs G-quadruplexes ADN ou ARN biologiquement pertinents (motif télomérique humain, répétitions minisatellites et séquences présentes dans les UTR de différents ARNm), dans le but d'obtenir des sondes spécifiques de ces conformations.Guanine-rich DNA or RNA sequences can adopt non-canonical structures composed of four strands called guanines quadruplexes or G-quadruplexes. These structures are made by the formation and stacking of guanine quartets; they can be found in various region of the genome. G-quadruplexes motifs are frequently found during the selection of aptamers by the so-called SELEX method: a bias exists in the proportion of guanines in comparison with other nucleotides in a database gathering together known aptamers sequences. We did an in silico then in vitro systematic analysis of aptameric motifs described in the literature. We used a prediction algorithm currently developed in the laboratory to determine which sequences car form G-quadruplexes in silico. In order to check those predictions, a biophysical test allowing to quickly assay a lot of sequences was set up. Our results demonstrate that a lot of published aptamers are able to fold into G-quadruplexes. Another part of this work is related to the use of the SELEX with two different goals. First of all we did an in vitro selection against a G-quadruplexes ligand, in order to tell exactly which nucleic motifs can interact with this molecule. We then carried out SELEX experiments against several DNA or RNA biologically relevant G-quadruplexes (human telomeric motifs, minisatellite repetitions and sequences from UTR of mRNA), with the aim of getting specific probes for these conformations

Prédiction des facteurs de risque conduisant à l'emphysème chez l'homme par utilisation de techniques diagnostiques

Les broncho-pneumopathies chroniques obstructives (BPCO) constituent un groupe de maladies des poumons caractérisées par le blocage du passage de l air, rendant la respiration de plus en plus difficile. L emphysème et la bronchite chronique sont les deux principales affections parmi les BPCO, mais les BPCO peuvent également être provoquées par les dégâts causés par des bronchites chroniques asthmatiques. L emphysème pulmonaire est une maladie pulmonaire caractérisée par l élargissement des espaces aériens distaux en amont des bronchioles terminales non respiratoires, accompagné de la destruction des parois alvéolaires. Ces modifications du parenchyme pulmonaire sont pathognomoniques de l emphysème. La bronchite chronique est une forme de bronchite caractérisée par une production excessive d expectoration, entraînant l apparition d une toux chronique et l obstruction des voies respiratoires. Dans toutes ces affections, les dégâts causés aux voies respiratoires finissent par affecter les échanges gazeux dans les poumons. L emphysème est généralement diagnostiqué de façon indirecte, sur la base d un examen clinique, d explorations de la fonction respiratoire (EFR), et d une évaluation visuelle subjective des scanners des tomodensitogrammes. Ces tests présentent une valeur limitée dans les cas d emphysème léger ou modéré. La présente étude aborde la possibilité d appliquer une démarche d analyse non linéaire à la répartition de la densité de l air au sein de l arbre des voies respiratoires des poumons à un quelconque niveau des ramifications. Les images sources de tomodensitométrie (TDM) du poumon sont traitées en deux phases, afin de produire un coefficient fractal de répartition de la densité de l air. Au cours de la première phase, les valeurs brutes de pixel des images sources correspondant à toutes les densités d air possibles sont traitées par un outil logiciel, mis au point pour construire une image cible. On y parvient par suppression en cascade des éléments indésirables (SCEI) : une étape de prétraitement dans l analyse de l image source. Celle-ci permet d identifier les valeurs de densité d air au sein de l arbre des voies respiratoires, tout en éliminant toutes les valeurs non relatives à la densité de l air. La seconde phase consiste en une réduction itérative de la résolution (RIR). Chaque réduction de la résolution produit un nouvel histogramme. Chaque histogramme ainsi produit comporte un certain nombre de pics, chacun d entre eux correspondant à un ensemble de densités d air. La courbe mettant en relation chaque réduction de la résolution avec le nombre de pics correspondant, obtenus à la résolution concernée, est tracée. Ceci permet de calculer la dimension fractale par une régression linéaire sur un graphique log log.Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) refers to a group of lung diseases that block airflow and make it increasingly difficult for you to breathe. Emphysema and chronic bronchitis are the two main conditions that make up COPD, but COPD can also refer to damage caused by chronic asthmatic bronchitis. Pulmonary emphysema is defined as a lung disease characterized by abnormal enlargement of the air spaces distal to the terminal, non-respiratory bronchiole, accompanied by destructive changes of the alveolar walls . These lung parenchymal changes are pathognomonic for emphysema. Chronic bronchitis is a form of bronchitis characterized by excess production of sputum leading to a chronic cough and obstruction of air flow. In all cases, damage to your airways eventually interferes with the exchange of oxygen and carbon dioxide in your lungs. Habitual techniques of emphysema s diagnosis are based on indirect features, such as clinical examination; Pulmonary Function Tests (PFT) and subjective visual evaluation of CT scans. These tests are of limited value in assessing mild to moderate emphysema. The presented work discusses the possibility of applying a nonlinear analysis approach on air density distribution within lung airways tree at any level of branching. Computed Tomography (CT) source images of the lung are subjected to two phases of treatment in order to produce a fractal coefficient of the air density distribution. In the first phase, raw pixel values from source images, corresponding to all possible air densities, are processed by a software tool, developed in order to, construct a product image. This is done through Cascading Elimination of Unwanted Elements (CEUE): a preprocessing analysis step of the source image. It identifies values of air density within the airways tree, while eliminating all non-air-density values. Then, during the second phase, in an iterative manner, a process of Resolution Diminution Iterations (RDI) takes place. Every resolution reduction produces a new resultant histogram. A resultant histogram is composed of a number of peaks, each of which corresponding to a cluster of air densities. A curve is plotted for each resolution reduction versus the number of peaks counted at this particular resolution. It permits the calculation of the fractal dimension from the regression slope of log-log power law plot.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Thérapie cellulaire par progéniteurs cardiaques issus de cellules souches embryonnaires dans un modèle porcin de dysfonction ventriculaire droite par surcharge chronique

Le pronostic à long terme de certaines cardiopathies congénitales se complique de dysfonction ventriculaire droite (VD) sévère répondant peu au traitement classique de l insuffisance cardiaque. La thérapie cellulaire pourrait être une solution thérapeutique. Les buts de cette étude ont été 1 / de créer un modèle expérimental de dysfonction VD par surcharge telle qu on l observe dans les cardiopathies congénitales, 2/ d appliquer sur cette dysfonction VD une thérapie cellulaire par progéniteurs cardiaques issus de cellules souches embryonnaires humaines. Nous avons caractérisé chez le gros animal un modèle de dysfonction VD par surcharge chronique combinée en reproduisant chirurgicalement les lésions de la voie d éjection droite de la tétralogie de Fallot réparée. Après 4 mois d évolution, nous avons retrouvé les différents aspects d une dysfonction VD : sur le plan hémodynamique une altération de la contractilité, sur le plan électro-physiologique un allongement de la durée du complexe QRS et des potentiels d action, sur le plan structural un remodelage myocardique débutant. Sur ce modèle de dysfonction VD, nous avons testé les effets d injections multiples intra-myocardiques directes de progéniteurs cardiaques issus de cellules souches embryonnaires humaines. Nous avons constaté une amélioration de la contractilité myocardique, une stabilisation des effets délétères de la surcharge chronique sur la fonction cardiaque ainsi que l absence d arythmie ventriculaire et de tératome. Ce premier essai encourageant de thérapie cellulaire par progéniteurs cardiaques apparait comme une nouvelle approche thérapeutique intéressante de la dysfonction VD par surcharge chroniquePARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Implication de la chimiokine CXCL12 et de ses récepteurs CXCR4 et CXCR7 dans le coeur sain et en situations pathologiques

Les chimiokines sont impliquées dans la chimioattraction. Dans le domaine cardiovasculaire, des études ont suggéré que les chimiokines pourraient être des médiateurs de la fonction cardiaque. L objectif de ma thèse a été de définir dans le tissu cardiaque, le rôle de la chimiokine CXCL12 à travers sa liaison à chacun de ses récepteurs : CXCR4 et CXCR7. Les travaux présentés dans ce mémoire ont permis de mettre en évidence pour la première fois : l expression protéique et la localisation dans les cardiomyocytes de l isoforme spécifique CXCL12g et des récepteurs CXCR4, CXCR7, suggérant que cette chimiokine pourrait à travers ses récepteurs agir selon un système autocrine/paracrine. CXCL12 via ses deux récepteurs CXCR4 et CXCR7 apparaît comme un acteur incontournable dans l organogenèse comme dans la fonction normale et pathologique du cœur.Chemokines are involved in chemoattraction. Some studies realized on normal heart and during cardiac pathological condition suggested that these proteins could be considered as key protein of cardiac fonction. The purpose of my thesis was to define in cardiac tissue the role of the chemokine CXCL12 via its interaction with these two receptors: CXCR4 and CXCR7. Findings presented in this report show for the first time that the protein expression and localization of CXCL12g isoforme and CXCR4 CXCR7 receptors in cardiac myocytes suggested that CXCL12 could acts via these two receptors as an autocrine/paracrine system. The chemokine CXCL12 via its two receptors CXCR4 and CXCR7 represented a key protein in the cardiac organogenesis as in normal and pathological cardiac functionPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Mécanismes inflammatoires liés à l'activation des fibres sensitives de la patte postérieure de rat (implication dans l'oedème provoqué par une hypertension veineuse aiguë. Effets des composés INO 5042 et INO 5207)

Nous nous sommes intéressés aux mécanismes inflammatoires liés à l'activation des fibres sensitives du nerf , saphène, plus particulièrement aux effets de la substance P. Dans cette optique, eux modèles expérimentaux ont été mis en place, permettant de mesurer indépendamment, au niveau de la patte postérieure de rat, la vasodilatation périphérique et le volume d'oedème consécutifs à une courte stimulation du nerf saphène. Conjointement à l'activation directe des cellules endothéliales, phénomène classiquement décrit dans la littérature, l'œdème provoqué par la substance P est fortement dépendant de l'histamine libérée par les mastocytes. Les cystéinyl-leucotriènes, d'origine leucocytaire, jouent également un rôle prépondérant dans le développement de l'œdème neurogène. La dégranulation leucocytaire serait sous la dépendance du PAF. L'absence d'effet des inhibiteurs deCOX sur l'œdème neurogène exclut une participation des prostaglandines au phénomène inflammatoire observé. Cette étude souligne également l'importance du NO dans la mise en place de l'œdème. La NOS endothéliale joue un rôle protecteur. Le NO d'origine endothéliale piègerait les dérivés de l'oxygène, agents pro- inflammatoires libérés par les mastocytes. A l'inverse, la NOS neuronale favoriserait le développement de l'œdème et de la vasodilatation provoqués par la stimulation du nerf saphène, en activant la libération des neuropeptides. Cette étude s'est également intéressée à l'implication possible de l'inflammation neurogène dans l'initiation de l'insuffisance veineuse chronique. Ainsi, le CGRP et la substance P participent au développement de l'œdème provoqué par une hyperpression veineuse aiguë, et ceci dès les premières minutes. De plus, ce phénomène inflammatoire est réduit par le INa 5207, composé inhibant également l'œdème neurogène. Le INa 5207 est toutefois moins efficace sur la vasodilatation neurogène, laissant supposer la présence de deux sites distincts et/ou l'expression du récepteur limitée à certaines fibres sensitives du nerf saphène.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Rôle des corticostéroïdes dans la régulation du canal calcique de type T Cav3.1 dans les myocytes cardiaques

L ion calcium est un second messager intracellulaire ubiquitaire jouant un rôle majeur dans de très nombreux processus cellulaires fondamentaux. Dans le cœur de rat, le courant calcique de type T, ICaT, est associé à l activité pacemaker au cours de développement, disparaît quelques jours après la naissance pour réapparaître au cours de la pathologie cardiaque. Par ailleurs, il a été montré que dans ce contexte pathologique, les corticostéroïdes sont capables d induire un remodelage ionique. Les travaux qui font l objet de cette thèse, ont été réalisés sur des cultures de myocytes cardiaques de rat nouveau-nés. Nous avons montré que la dexaméthasone (Dex) induit une augmentation de l expression du canal calcique de type T, Cav3.1. Il s avère que la Dex, comme l aldostérone, active le promoteur du gène codant pour Cav3.1. La séquence nucléotidique du promoteur révèle des sites putatifs de fixation de plusieurs facteurs de transcription tels que GR et NFkB. L application de la Dex sur les cellules entraîne une augmentation de la synthèse des GR et de NFkB, laquelle est suivie par une translocation vers le noyau. Nous avons montré, par l utilisation d inhibiteurs, que GR et NFkB ont un effet positif sur l expression de Cav3.1. Des mutations réalisées sur des sites putatifs de fixation des GR (GRE) montrent que la Dex et l aldostérone induisent l activité du promoteur via des GRE spécifiques du corticostéroïde utilisé. Enfin, la Dex induit l activation des voies de signalisation P38 et ERK1/2 ; ces deux voies de signalisation exerçant des effets antagonistes sur l activité du promoteur. Ces résultats mettent en lumière le rôle des corticostéroïdes dans l expression du canal calcique Cav3.1 ainsi que les voies de signalisation qui lui sont associées. L ensemble de ces travaux conduit à s interroger sur le rôle de la signalisation calcique générée par ICaT dans un contexte pathologique lié aux corticostéroïdes.: T-type calcium current (ICaT) is thought to be involved in fine-tuning of basal Ca2+ levels and may activate several local cellular processes. In heart, ICaT is related with the spontaneous activity of pacemaker cells during development and rapidly disappears after birth. However, ICaT channels are re-expressed during pathology in animal models of cardiac hypertrophy and heart failure. Moreover, numerous studies describe the role of corticosteroids in ionic remodelling associated with pathology. Here, we reported that corticosteroids induced the expression of T-type calcium channel Cav3.1 in rat neonatal cardiac myocytes. Both dexamethasone (Dex) and Aldosterone (Aldo) induced the increase of Cav3.1 mRNA. The characterization of cacna1g promoter demonstrates that Dex and Aldo increases promoter activity via a 200 bp responsive region. Sequence analysis of this region reveals putative binding sites for regulatory factors including GRE and NF B elements. Our results indicate that Dex increases both GR and NFkB synthesis and nuclear translocation. More, both GR and NF B were necessary to trigger the increase in Cav3.1 mRNA amount. Using a punctual mutagenesis approach, we have demonstrated that Dex and Aldo activate the promoter via GR through specific GRE. Moreover, we demonstrated that Dex induced promoter activity through the activation of P38 signalling pathways. In contrast, the activation of ERK1/2 induced a feed back negative in promoter activity induced by Dex. Our finding revealed new mechanisms and signalling pathways involved in the regulation of Cav3.1 expression leading to a better understanding of the impact of the Ca2+ influx generated by ICaT during cardiac development and pathology.PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF