Μελέτη αυτοσωματικής επικρατούσας μορφής πολυκυστικής νόσου των νεφρών (ΑΕΠΝΝ) τύπου 1 και 2 στην Κύπρο

The aim of this study is the clinical presentation of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, type 1 and 2 among Cypriot families. We report on a study designed to compare the diagnostic sensitivity and specificity of renal ultrasound in ADPKD1 & 2 and also to define the clinical differences between these two diseases. The material consisted of a) 121 live members at 50% risk of the disease in 11 Cypriot families with ADPKD1 and b) 230 live members in 3 families with ADPKD2. DNA genetic linkage or/and mutation analyses were used to categorize 351 members into affected and non affected for ADPKD1 & 2. A detailed renal and hepatic ultrasound examination was used for diagnosing ADPKD. In addition, a detailed medical history, clinical examination and laboratory tests were obtained. A comparative analysis of the prevalence of chronic renal failure (CRF), hypertension, liver cysts, episodes of renal pain, nephrolithiasis, hematuria and urinary tract infection in 351 live ADPKD1 & 2 patients has been completed. Using data from 42 additional patients in these families who died with this disease (22 for ADPKD1 and 20 for ADPKD2), we also defined their causes of death, and compared the mean ages at end stage renal failure (ESRF) and death together with time of survival on dialysis. The results showed that: 1. Ultrasound diagnosis of ADPKD1 can reliably be made at age 20 and over while in ADPKD2 the critical age is 30. In ADPKD1 the overall false positive rate was only 1,8% and false negative rate 10,6%. In ADPKD2 the overall false positive rate was 9,5% and the false negative rate 15,2%. 2. In the live patients, CRF developed in 33,3% of ADPKD1 patients compared to 10,9% in ADPKD2 (p=0,0003). Taking into account the diseased patients too, this difference was 50% against 24,6% (p< 0,001). In ADPKD1 the mean age at ESRF was 52,8 years, mean survival on dialysis 7,1 years and mean age death 59,9 years. In ADPKD2 the corresponding figures were 65,7 years (p< 0,001), 5,1 years (p< n.s.) and 70,7 years (p< 0,005). There was no significant difference in the prevalence of episodes of renal pain, nephrolithiasis, hematuria and urinary tract infections. The prevalence of hypertension in ADPKD1 was 33,3% and the mean age of onset 36,4 years. In ADPKD2 the prevalence was lower at 26,4% and the mean age of onset later at 42,6 yrs. The differences did not reach statistical significance. Significant differences were observed in overall prevalence of hepatic cysts. This was 24,2% in ADPKD1 compared to 10% in ADPKD2 (p=0,02). In conclusion, DNA analysis remains the gold standard for the diagnosis of ADPKD1 & 2 especially in young people. Under the age of 15, ultrasound is not recommended as a routine diagnostic procedure. Ultrasound becomes 100% reliable in excluding ADPKD1 in family members at 50% risk, over the age of 20 and in ADPKD2 families over the age of 30. Hepatic cysts and CRF develop more frequently and at a younger age in ADPKD1 compared to ADPKD2. At the same time patients with ADPKD2 reach ESRF much later than ADPKD1 patients and die much later. This detailed, comparative study conclusively confirms that ADPKD1 is more severe disease than ADPKD2.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η κλινική μελέτη της αυτοσωματικής επικρατούσας πολυκυστικής νόσου των νεφρών (ΑΕΠΝΝ) τύπου 1 και 2, στις Κυπριακές οικογένειες. Επίσης σκοπό έχει να συσχετίσει τη διαγνωστική ειδικότητα και ευαισθησία του νεφρικού υπέρηχου στην ΑΕΠΝΝ1 & 2 και να περιγράψει τις κλινικές διαφορές μεταξύ των δύο τύπων της νόσου σε ένα ομοιογενή πληθυσμό όπως είναι ο Κυπριακός. Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν α) 121 εν ζωή μέλη, με 50% κίνδυνο να παρουσιάσουν τη νόσο, από 11 ΑΕΠΝΝ1 οικογένειες, β) 230 εν ζωή μέλη, με 50% κίνδυνο, να παρουσιάσουν τη νόσο από 3 ΑΕΠΝΝ2 οικογένειες. Για την κατηγοριοποίηση των υπό μελέτη 351 μελών, σε φορείς/ασθενείς και μη φορείς για τον τύπο 1 και 2 της ΑΕΠΝΝ χρησιμοποιήθηκε η γενετική DNA ανάλυση σύνδεσης ή/και η άμεση ανίχνευση μεταλλάξεις. Όλα τα εν ζωή 351 μέλη υπεβλήθηκαν σε λεπτομερή υπερηχογραφικό έλεγχο νεφρών και ήπατος με σκοπό τη διάγνωση της ΑΕΠΝΝ. Επίσης τα ίδια μέλη υπεβλήθηκαν σε φυσική εξέταση, λήψη ιστορικού με καταγραφή των χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της νόσου με ιδιαίτερη έμφαση στην επίπτωση της υπέρτασης και χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας καθώς και σε εργαστηριακές εξετάσεις. Ακολούθησε συγκριτική ανάλυση της επίπτωσης της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας (ΧΝΑ), της υπέρτασης, των επεισοδίων νεφρικού πόνου, νεφρολιθίασης, αιματουρίας, ουρολοιμώξεων καθώς και της επίπτωσης των ηπατικών κύστεων στον τύπο 1 και 2 της ΑΕΠΝΝ. Ταυτόχρονα μελετήθηκαν 42 αποβιώσαντες ασθενείς, 22 με ΑΕΠΝΝ1 και 20 με ΑΕΠΝΝ2 και έγινε συγκριτική μελέτη της μέσης ηλικίας ΤΣΧΝΑ, μέσης ηλικίας θανάτου και μέσης επιβίωσης στην αιμοκάθαρση για τους 2 τύπους. Επίσης μελετήθηκαν τα αίτια θανάτου στους ΑΕΠΝΝ1 και ΑΕΠΝΝ2 ασθενείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: 1. Υπερηχογραφική διάγνωση της ΑΕΠΝΝ1 μπορεί να τεθεί με ασφάλεια σε ηλικίες 20 και άνω ενώ της ΑΕΠΝΝ2 σε ηλικίες 30 ετών και άνω, σε μέλη με 50% κίνδυνο να παρουσιάσουν τη νόσο. Στα μέλη των οικογενειών με ΑΕΠΝΝ1 συνολικά για όλες τις ηλικίες, ψευδώς θετικός υπέρηχος καταγράφηκε στο 1,8% και ψευδώς αρνητικός στο 10,6%. Αντίθετα στα μέλη των οικογενειών με ΑΕΠΝΝ2 ψευδώς θετικός υπέρηχος καταγράφηκε συνολικά στο 9,5% και ψευδώς αρνητικός στο 15,2% των υπό μελέτη μελών. 2. Στα εν ζωή μέλη, ΧΝΑ καταγράφηκε στο 33,3% των ΑΕΠΝΝ1 ασθενών και μόνο στο 10,9% των ΑΕΠΝΝ2 (p=0,0003). Συνυπολογίζοντας και τους αποβιώσαντες ασθενείς, η διαφορά αυτή στην επίπτωση της ΧΝΑ, ανέρχετο σε 50% για τους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ1 και 24,6% για τους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ2 (p< 0,001). Στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ1, η μέση ηλικία ΤΣΧΝΑ ήταν τα 52,8 έτη, η μέση επιβίωση στην αιμοκάθαρση τα 7,1 και η μέση ηλικία θανάτου τα 59,9 έτη. Αντίθετα στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ2 τα αντίστοιχα αποτελέσματα ήταν τα 65,7 έτη (p< 0,001), τα 5,1 έτη (p< n.s) και τα 70,7 έτη (p< 0,005). εν καταγράφηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην επίπτωση των επεισοδίων νεφρικού πόνου, νεφρολιθίασης, αιματουρίας και ουρολοιμώξεων. Η επίπτωση της υπέρτασης στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ1 ήταν 33,3% με μέση ηλικία πρωτοδιάγνωσης τα 36,4 έτη ενώ στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ2 ήταν χαμηλότερη, στο 26,4% με μέση ηλικία πρωτοδιάγνωσης τα 42,6 έτη. Οι πιο πάνω διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Στατιστικά σημαντικές διαφορές καταγράφηκαν στη συνολική επίπτωση των ηπατικών κύστεων και ήταν 24,2% στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ1 ενώ στους ασθενείς με ΑΕΠΝΝ2 μόνο 10% (p=0,02). Συμπερασματικά θα λέγαμε ότι η γενετική DNA ανάλυση παραμένει το πιο αξιόπιστο διαγνωστικό εργαλείο για νεαρά άτομα με ΑΕΠΝΝ τύπου 1 ή 2. Σε ηλικίες κάτω των 15 ετών, ο νεφρικός υπέρηχος δεν συστήνεται ως μέθοδος ρουτίνας για τη διάγνωση της νόσου σε ασυμπτωματικά άτομα. Αντίθετα σε ηλικίες άνω των 20 ετών ο υπέρηχος είναι 100% αξιόπιστος για τον αποκλεισμό της ΑΕΠΝΝ1, σε μέλη με 50% κίνδυνο να παρουσιάσουν τη νόσο και αντίστοιχα σε ηλικίες άνω των 30 για τον αποκλεισμό της ΑΕΠΝΝ2. Ηπατικές κύστεις και ΧΝΑ παρουσιάζονται συχνότερα και σε νεαρότερη ηλικία στην ΑΕΠΝΝ1 σε σύγκριση με την ΑΕΠΝΝ2. Επίσης οι ασθενείς με ΑΕΠΝΝ2 φτάνουν σε ΤΣΧΝΑ, πολύ αργότερα από τους ΑΕΠΝΝ2 ασθενείς και καταλήγουν σε μεγαλύτερη ηλικία. Αυτή η λεπτομερής συγκριτική μελέτη επιβεβαιώνει και τεκμηριώνει ότι η ΑΕΠΝΝ2 είναι ηπιότερη νόσος σε σύγκριση με την ΑΕΠΝΝ1

Frequency of COL4A3/COL4A4 mutations amongst families segregating glomerular microscopic hematuria and evidence for activation of the unfolded protein response. Focal and segmental glomerulosclerosis is a frequent development during ageing.

Familial glomerular hematuria(s) comprise a genetically heterogeneous group of conditions which include Alport Syndrome (AS) and thin basement membrane nephropathy (TBMN). Here we investigated 57 Greek-Cypriot families presenting glomerular microscopic hematuria (GMH), with or without proteinuria or chronic kidney function decline, but excluded classical AS. We specifically searched the COL4A3/A4 genes and identified 8 heterozygous mutations in 16 families (28,1%). Eight non-related families featured the founder mutation COL4A3-p.(G1334E). Renal biopsies from 8 patients showed TBMN and focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). Ten patients (11.5%) reached end-stage kidney disease (ESKD) at ages ranging from 37-69-yo (mean 50,1-yo). Next generation sequencing of the patients who progressed to ESKD failed to reveal a second mutation in any of the COL4A3/A4/A5 genes, supporting that true heterozygosity for COL4A3/A4 mutations predisposes to CRF/ESKD. Although this could be viewed as a milder and late-onset form of autosomal dominant AS, we had no evidence of ultrastructural features or extrarenal manifestations that would justify this diagnosis. Functional studies in cultured podocytes transfected with wild type or mutant COL4A3 chains showed retention of mutant collagens and differential activation of the unfolded protein response (UPR) cascade. This signifies the potential role of the UPR cascade in modulating the final phenotype in patients with collagen IV nephropathies

Genetic Variation of DKK3 May Modify Renal Disease Severity in ADPKD

Significant variation in the course of autosomal dominant polycystic kidney disease ( ADPKD) within families suggests the presence of effect modifiers. Recent studies of the variation within families harboring PKD1 mutations indicate that genetic background may account for 32 to 42% of the variance in estimated GFR (eGFR) before ESRD and 43 to 78% of the variance in age at ESRD onset, but the genetic modifiers are unknown. Here, we conducted a high-throughput single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping association study of 173 biological candidate genes in 794 white patients from 227 families with PKD1. We analyzed two primary outcomes: (1) eGFR and (2) time to ESRD (renal survival). For both outcomes, we used multidimensional scaling to correct for population structure and generalized estimating equations to account for the relatedness among individuals within the same family. We found suggestive associations between each of 12 SNPs and at least one of the renal outcomes. We genotyped these SNPs in a second set of 472 white patients from 229 families with PKD1 and performed a joint analysis on both cohorts. Three SNPs continued to show suggestive/significant association with eGFR at the Dickkopf 3 (DKK3) gene locus; no SNPs significantly associated with renal survival. DKK3 antagonizes Wnt/β-catenin signaling, which may modulate renal cyst growth. Pending replication, our study suggests that genetic variation of DKK3 may modify severity of ADPKD resulting from PKD1 mutations

Overexpression of wild type or mutant <i>COL4A3</i> chains induces XBP1 splicing in AB8/13 cells.

<p>(a) Representative experiment of reverse transcription-PCR using XBP1 mRNA as template, from AB8/13 cells transiently expressing <i>COL4A3</i>-WT (A3/WT) or the mutant chains G1334E, G871C, G484R (<i>COL4A3</i>). PCR products were run on 3% agarose gel. It is apparent that over-expression of all chains induces XBP1 splicing, as evidenced by the appearance of the spliced band (s) when the PCR product is cut with the restriction enzyme Pst1. (h) hybrid, (u) unspliced (b) RT-PCR is quantified via densitometric analysis of the bands after PstI digestion as follows: ratio of the spliced band and the sum of the two PstI digest bands (s/(u1+u2), with PstI digestion. Hybrid band (h) was considered as equally contributing to unspliced and spliced bands. There is statistically significant XBP1 splicing when either WT or any of the mutant chains is overexpressed in AB8/13 cells. L19 was used as an internal PCR control. Data are means ± SEM of three independent experiments.</p

Mutant <i>COL4A3</i> chains expressed in AB8/13 cultured podocytes demonstrate a trend for increased intracellular retention.

<p>(a) AB8/13 cells were transiently transfected with expression vectors containing wild-type <i>COL4A3</i>-WT or the mutant <i>COL4A3</i> (p.G1334E, p.G871C, p.G484R, p.A587G) cDNAs that included a HA epitope at C-terminus. Single chain expression was measured via Western blot analysis of the cell lysate, 48 h after transfection. No HA antigen was detected in AB8/13 cells transfected with a construct expressing the empty vectors. Shown is a representative Western blot of proteins in cell lysates. (b) All mutant chains show a trend towards increased intracellular retention as compared to the wild type chain, although not reaching significance at the 48 h time point. Shown is densitometry analysis data normalized to tubulin expression. Data are represented as means ± SEM of n≥3 independent experiments.</p

Mutations detected in <i>COL4A3</i> and <i>COL4A4</i> genes.

<p>*these mutations tested negative in an additional collection of 52 patients with chronic kidney disease.</p><p>**this mutation was detected only in a single patient during screening of 153 patient samples. It was subsequently detected in six of 120 Cypriot controls. It is a suspect founder mutation and is under further investigation.</p>+<p>these mutations tested negative in an additional collection of 40 patients with glomerulonephritis of unknown aetiology CY, Cypriot samples; RO, Romanian sample; ND: Not Done; NA: Not applicable.</p><p>Mutations detected in <i>COL4A3</i> and <i>COL4A4</i> genes.</p

Chaperone BiP protein and PERK, a transmembrane protein kinase of the PEK family resident in the endoplasmic reticulum membrane, are deregulated in AB8/13 podocytes transfected with various <i>COL4A3</i> mutant chains.

<p><b><u>a, c</u>:</b> AB8/13 cells were transiently transfected with expression vectors containing either wild-type <i>COL4A3</i> chain or one of several mutant chains. Transfection with lipofectamine only (lipo) served as a negative control. Protein expression of the UPR markers was measured 48 hours after transfection via Western blotting. β-tubulin expression in the same samples was used as equal loading control. Shown are representative blots with differential expression levels of BiP and p-PERK for the various mutant proteins. <b><u>b, d</u>:</b> Western blotting as above, was quantified via densitometric analysis. BiP and p-PERK are up-regulated in cells over-expressing the mutant <i>COL4A3</i>-p.(G1334E), <i>COL4A3</i>-p.(G871C) and <i>COL4A3</i>-p.(G484R) while there is a trend for <i>COL4A3</i>-p.(A587G), as compared to cells expressing the wild type chain. Data are means ± SEM (n = 4 for BiP; n = 7 for p-PERK) *p<0.05; **p<0.01.</p

Electropherograms showing causative mutations found in <i>COL4A3</i> (a) and in <i>COL4A4</i> (b) genes during the course of this work.

<p>In (c) is shown a 52 bp deletion in <i>COL4A4</i> which encompasses 50 bp of exon 20 plus the two conserved <b><i>gt</i></b> bp at the donor site of intron 20. In addition to the translation frameshift introduced, it is expected that aberrant splicing will occur.</p