A SUMO-regulated activation function controls synergy of c-Myb through a repressor–activator switch leading to differential p300 recruitment

Synergy between transcription factors operating together on complex promoters is a key aspect of gene activation. The ability of specific factors to synergize is restricted by sumoylation (synergy control, SC). Focusing on the haematopoietic transcription factor c-Myb, we found evidence for a strong SC linked to SUMO-conjugation in its negative regulatory domain (NRD), while AMV v-Myb has escaped this control. Mechanistic studies revealed a SUMO-dependent switch in the function of NRD. When NRD is sumoylated, the activity of c-Myb is reduced. When sumoylation is abolished, NRD switches into being activating, providing the factor with a second activation function (AF). Thus, c-Myb harbours two AFs, one that is constitutively active and one in the NRD being SUMO-regulated (SRAF). This double AF augments c-Myb synergy at compound natural promoters. A similar SUMO-dependent switch was observed in the regulatory domains of Sp3 and p53. We show that the change in synergy behaviour correlates with a SUMO-dependent differential recruitment of p300 and a corresponding local change in histone H3 and H4 acetylation. We therefore propose a general model for SUMO-mediated SC, where SUMO controls synergy by determining the number and strength of AFs associated with a promoter leading to differential chromatin signatures

Kovalent konjugering av SUMO til c-Myb's negativt regulatoriske domene : Etablering av en SUMO-sensor

Sammendrag Transkripsjonsfaktorer har en viktig rolle i normale cellefunksjoner, men har også vist seg å være involvert i kreftutvikling. Transkripsjonsfaktoren c-Myb spiller en betydelig rolle i hematopoiesen hvor den er involvert i kontroll av celledeling og spesialisering av ulike blodceller. Deregulering av c-Myb s nivå eller aktivitet antas å ha betydning ved utvikling av blodkreft. Aktiviteten av c-Myb reguleres hovedsakelig gjennom posttranslasjonelle modifikasjoner samt interaksjoner med ko-aktivatorer og ko-repressorer. Kovalente modifikasjoner, som fosforylering, acetylering, og ubiquitinering, antas å styre c-Myb s preferanser for interaksjonspartnere. Sumoylering er et eksempel på en kovalent modifikasjon som har blitt vist å påvirke aktiviteten til c-Myb. SUMO (small ubiquitin-like modifier) er et 100 aa stort peptid som bindes kovalent til lysinet i konsensussekvensen KXE. c-Myb inneholder to slike sumoyleringsseter i sitt negativt regulatoriske domene (NRD), og modifiseres av SUMO i begge setene (K503 og K527). Mutasjon av disse SUMO-akseptor lysinene (KR) eliminerer SUMO-modifikasjon og medfører en dramatisk økning av c-Myb s transkripsjonelle aktivitet. Lysinresiduer kan bli modifisert på mange ulike måter; acetylering, ubiquitinering og metylering er noen eksempler. På bakgrunn av dette var et av målene med denne oppgaven å undersøke om de store funksjonelle effektene av KR mutasjonene i c-Myb kun skyldtes tapt SUMO-konjugering, eller om andre lysindirigerte modifikasjoner også kunne være medvirkende. Dette ble gjort ved å lage nye mutanter som også forhindrer sumoylering, men uten å endre SUMO-akseptor lysinene (EA). Uttesting av EA mutantene viste hovedsakelig det samme transaktiverings- og modifiseringsmønster som de tilsvarende KR mutantene, noe som tyder på at tapt sumoylering er den viktigste årsaken til den økte aktiviteten hos sumoyleringsmotivmutantene. Ubalanse i sumoyleringssyklusen er funnet å ha betydning ved ulike sykdomsprosesser, og det ville derfor være interessant å kunne måle ulike celler og cellelinjers sumoyleringsaktivitet ved bruk av en egnet SUMO-sensor. Ulik grad av sumoylering ville da kunne avspeile eventuell ubalanse i SUMO-apparatet. c-Myb s NRD har evnen til å skifte fra et repressivt til et aktiverende domene avhengig av sumoyleringsstatus, og dette domenet er derfor en potensiell kandidat til utvikling av en slik SUMO-sensorsystem. For å undersøke om NRD av c-Myb, med de to sumoyleringsmotivene, kunne fungere som en SUMO-sensor ble det konstruert GAL4DBD-NRD fusjonskonstrukter med tilsvarende EA mutasjoner som for fullengde konstruktene. GAL4DBD-NRD EA og KR konstrukter ble sammenlignet, og alle konstruktene ble i tillegg testet under ulike aktivitetsmodulerende forhold, relatert både til sumoylering og ubiquitineringsapparatet. Forsøk utført i denne oppgaven viste at GAL4-NRD konstruktene (SUMO-sensoren) kan registrere endringer i SUMO-apparatet i form av desumoylering. Men det ble i tillegg også funnet at SUMO-sensorsystemet responderer på endringer i ubiquitineringsapparatet. Mulige løsninger på denne problematikken diskuteres. Det ble i denne forbindelse også gjort observasjoner som viste at usumoylert c-Myb-NRD har egenskaper som et klassisk transaktiveringsdomene (TAD), noe som antyder at NRD kan fungere som et betinget, SUMO-regulert TAD. Ved uttesting av SUMO-sensoren i prostatakreftcellelinjen LNCaP, som har et forhøyet uttrykk av SUMO-proteasen SENP1, var disse endringene målbare med sensoren. Dette gir håp om at SUMO-sensorsystemet, ved innføring av visse kriterier, kan være et brukbart verktøy for måling av forandringer i SUMO-apparatet

Shedding of syndecan-4 promotes immune cell recruitment and mitigates cardiac dysfunction after lipopolysaccharide challenge in mice

Inflammation is central to heart failure progression. Innate immune signaling increases expression of the transmembrane proteoglycan syndecan-4 in cardiac myocytes and fibroblasts, followed by shedding of its ectodomain. Circulating shed syndecan-4 is increased in heart failure patients, however the pathophysiological and molecular consequences associated with syndecan-4 shedding remain poorly understood. Here we used lipopolysaccharide (LPS) challenge to investigate the effects of syndecan-4 shedding in the heart. Wild-type mice (10 mg/kg, 9 h) and cultured neonatal rat cardiomyocytes and fibroblasts were subjected to LPS challenge. LPS increased cardiac syndecan-4 mRNA without altering full-length protein. Elevated levels of shedding fragments in the myocardium and blood from the heart confirmed syndecan-4 shedding in vivo. A parallel upregulation of ADAMTS1, ADAMTS4 and MMP9 mRNA suggested these shedding enzymes to be involved. Echocardiography revealed reduced ejection fraction, diastolic tissue velocity and prolonged QRS duration in mice unable to shed syndecan-4 (syndecan-4 KO) after LPS challenge. In line with syndecan-4 shedding promoting immune cell recruitment, expression of immune cell markers (CD8, CD11a, F4/80) and adhesion receptors (Icam1, Vcam1) were attenuated in syndecan-4 KO hearts after LPS. Cardiomyocytes and fibroblasts exposed to shed heparan sulfate-substituted syndecan-4 ectodomains showed increased Icam1, Vcam1, TNFα and IL-1β expression and NF-κB-activation, suggesting direct regulation of immune cell recruitment pathways. In cardiac fibroblasts, shed ectodomains regulated expression of extracellular matrix constituents associated with collagen synthesis, cross-linking and turnover. Higher syndecan-4 levels in the coronary sinus vs. the radial artery of open heart surgery patients suggested that syndecan-4 is shed from the human heart. Our data demonstrate that shedding of syndecan-4 ectodomains is part of the cardiac innate immune response, promoting immune cell recruitment, extracellular matrix remodeling and mitigating cardiac dysfunction in response to LPS

Myrrestaurering 2015. Etablering av overvåkingsmetodikk for vegetasjon og grunnlagsanalyse før restaureringstiltak på Kaldvassmyra, Aurstadmåsan og Midtfjellmosen

Hagen, D., Aarrestad, P.A., Kyrkjeeide, M.O., Foldvik, A., Myklebost, H.E., Hofgaard, A., Kvaløy, P. & Hamre, Ø. 2015. Myrrestaurering 2015. Etablering av overvåkingsmetodikk for vegetasjon og grunnlagsanalyse før restaureringstiltak på Kaldvassmyra, Aurstadmåsan og Midtfjellmosen - NINA Rapport 1212, 43 s. Myr er en viktig naturtype med stort biologisk mangfold og produserer viktige økosystemtjenester som karbonlager og flomdemping. Myrene er utsatt for sterkt press i form av grøfting og andre tekniske inngrep på grunn av for eksempel skogreising og oppdyrking. De fleste myrer i lavlandet har i dag spor etter tidligere grøfting. Økologisk restaurering er nødvendig for å reversere tapet av natur og et virkemiddel for framtidig forvaltning og opp-rettholdelse av økosystemtjenester. I en rekke europeiske land er det gjennomført store rest-aureringsprosjekter med tetting av grøfter og heving av vannstand i myrer, men i Norge er det foreløpig lite erfaring med slike tiltak. Miljødirektoratet satte i 2015 i gang et prosjekt for å restaurere 18 grøftede myrer i verneom-råder for å få tilbake myrenes naturlige hydrologiske og biologiske funksjon. For å måle effek-ten av restaureringstiltakene på naturmangfold og hydrologi skal det etableres systematisk overvåking i noen utvalgte myrer. Denne rapporten beskriver etablering av overvåkingsmeto-dikk for vegetasjon og terreng og resultater fra basisanalysene på tre ombrotrofe myrer som etter planen skal restaureres i 2016; Kaldvassmyra i Nord-Trøndelag og Aurstadmåsan og Midtfjellmosen i Akershus. Metodene gjør det mulig å fange opp endringer over tid på ulike skalanivå, fra fotografering av områdene med drone (makro-skala), innsamling av data om myrstrukturer og vegetasjon (meso-skala) og arter (mikro-skala). Alle tre myrene er grøfta og vegetasjonen er påvirka av endra vannstand over lang tid. I hvert overvåkingsområde ble det lagt ut transekt på tvers av grøfter som skal plugges. I til-legg er det lagt ut et referanse-transekt på hver myr et stykke unna grøftene som ikke skal bli direkte påvirket av restaureringstiltakene. Alle studieområdene ble fotografert fra lufta med en multirotor-drone utstyrt med kamera. Referansepunkter ble innhentet med differensial-GPS (2-3 cm nøyaktighet). Bildene ble prosessert sammen med referansepunktene og det ble la-get ortofoto og høydemodell. Resultatene viser at en med enkelt utstyr effektivt kan generere både ortofoto og høydemodell av relativt store områder med høy oppløsning og presisjon. Gjentak av dronofotografering gir høydemodeller for nøyaktig samme område på ulike tids-punkt og disse vil kunne sammenliknes statistisk ved bruk av GIS for å måle terrengsendring-er. Langs alle transektene ble markslag, tresjikt busksjikt, feltsjikt og bunnsjikt. I tillegg ble det gjort artsregistrering som punktfrekvensanalyser i kortere linjer langs transektene. Til sammen ble det lagt ut og analysert 13 transekt og 64 artslinjer på de tre myrene. Det virker som grøf-tene drenerer vann ut fra nærliggende områder og det er større innsalg av torvmark og tuer i nærheten av grøftene, mens det blir mer hølje-tue-struktur lengre fra grøftene. Fordi transek-tene krysser grøfter som skal plugges blir det mulig å måle den direkte effekten av restaure-ringstiltak i forhold til avstanden fra tiltaket. Resultatene fra artsregistreringene beskriver den variasjonen og artsammensetningen vi kan forvente i denne typen myr. Videre har vi fanget opp arter som vil fungere som gode indikatorer for endring over tid. Transektene fanger også opp hovedtypene av strukturer og arter i myr, slik at registreringene vil ha en overføringsverdi til framtidige tiltak i andre myrer. Det kan være aktuelt å etablere en forenklet overvåking basert på dronefotografering i et stort antall myrer, mens det gjøres full overvåking etter metoden skissert i rapporten i et mindre antall myrer. Det anbefales å gjøre en første gjenanalyse kort tid etter gjennomført tiltak og gjenanalyser hvert femte år i tråd med andre overvåkingsprogrammer for vegetasjon.Mires are important ecosystems for biodiversity and support of ecosystem services as carbon storage and flood-regulation. Mires are under heavy pressure from ditching and other tech-nical disturbances, due to afforestation and cultivation. Most lowland mires have been ditched long time ago or more recently. Ecological restoration is needed to restore degraded nature, and is a tool for future management and maintenance of ecosystem services. Several Europe-an countries have restoration experiences of blocking ditches and raise water level in mire ecosystems, while Norway have limited experiences with such actions. The Norwegian Environmental Agency startet in 2015 a project to restore 18 ditched mires in protected areas to re-establish the original hydrological and ecological functions. A monitoring program will be established to measure the effects of the restoration actions on biodiversity and hydrology. This report describes the methods for monitoring of terrain and vegetation and presents the results from the baseline registration of three ombrotrophic mires (raised bogs) that will be restored in 2016; Kaldvassmyra in Nord-Trøndelag county and Aurstadmåsan and Midtfjellmosen in Akershus county. The methods will analyse changes over time at different scales: as photo taken by drones (macro-scale), collecting data on vegetation and surface structures (meso-scale) and species (micro-scale). All three bogs have been ditched and the vegetation have been affected by changes in water level for decades. Transects were established across ditches that will be plugged in all monitoring sites. In addi-tion, a reference transect is established in an area of the bogs that will not be affected by the restoration measure. In all the study sites, photos were taken by camera carried by a multi-rotor drone. Ground reference points were established using a differential GPS (2-3 cm er-ror). The pictures were processed together with the reference points to produce orthophoto and a digital elevation model. The results show that it is not too expensive and complicated to establish these data for quite large areas with the resolution needed for this purpose. By re-peating the drone-picture for the same area after the restoration, the changes in elevation can be tested statistically and visually. The surface structures, the tree layer, bush cover, and field- and bottom layer were recorded along all transects. Species data was recorded as point frequency analysis in part of the transects (species lines). All together we established 13 tran-sects and 64 species lines. The ditches seem to drain water from the close surroundings and the frequency of turfs and dryer peat soil is higher close to the ditches, while hollows and wetter structures are more common further away. Because all transect cross the ditches, it will be possible to measure the effects of the restoration related to distance from the ditch. The data from species data show the variation and diversity that can be expected in this type of bogs. This variation include species that can work as indicators for ecological changes over time. The transects catch the typical structures of raised bogs and the data will also be rele-vant for future restoration in other bogs. One option is to establish a simplified monitoring based on drone-photo in a high number of bogs, and do the full monitoring including vegetation and species transects in a limited number of bogs. We suggest doing the first re-analysis short time after the restoration actions, and future monitoring at five-year cycles in line with other national monitoring program for vegeta-tion.© Norsk institutt for naturforskning. Publikasjonen kan siteres fritt med kildeangivelse

Exercise training increases protein O-GlcNAcylation in rat skeletal muscle

Protein O‐GlcNAcylation has emerged as an important intracellular signaling system with both physiological and pathophysiological functions, but the role of protein O‐GlcNAcylation in skeletal muscle remains elusive. In this study, we tested the hypothesis that protein O‐GlcNAcylation is a dynamic signaling system in skeletal muscle in exercise and disease. Immunoblotting showed different protein O‐GlcNAcylation pattern in the prototypical slow twitch soleus muscle compared to fast twitch EDL from rats, with greater O‐GlcNAcylation level in soleus associated with higher expression of the modulating enzymes O‐GlcNAc transferase (OGT), O‐GlcNAcase (OGA), and glutamine fructose‐6‐phosphate amidotransferase isoforms 1 and 2 (GFAT1, GFAT2). Six weeks of exercise training by treadmill running, but not an acute exercise bout, increased protein O‐GlcNAcylation in rat soleus and EDL. There was a striking increase in O‐GlcNAcylation of cytoplasmic proteins ~50 kDa in size that judged from mass spectrometry analysis could represent O‐GlcNAcylation of one or more key metabolic enzymes. This suggests that cytoplasmic O‐GlcNAc signaling is part of the training response. In contrast to exercise training, postinfarction heart failure (HF) in rats and humans did not affect skeletal muscle O‐GlcNAcylation level, indicating that aberrant O‐GlcNAcylation cannot explain the skeletal muscle dysfunction in HF. Human skeletal muscle displayed extensive protein O‐GlcNAcylation that by large mirrored the fiber‐type‐related O‐GlcNAcylation pattern in rats, suggesting O‐GlcNAcylation as an important signaling system also in human skeletal muscle

Molecular Basis of Calpain Cleavage and Inactivation of the Sodium-Calcium Exchanger 1 in Heart Failure

Cardiac sodium (Na+)-calcium (Ca2+) exchanger 1 (NCX1) is central to the maintenance of normal Ca2+ homeostasis and contraction. Studies indicate that the Ca2+-activated protease calpain cleaves NCX1. We hypothesized that calpain is an important regulator of NCX1 in response to pressure overload and aimed to identify molecular mechanisms and functional consequences of calpain binding and cleavage of NCX1 in the heart. NCX1 full-length protein and a 75-kDa NCX1 fragment along with calpain were up-regulated in aortic stenosis patients and rats with heart failure. Patients with coronary artery disease and sham-operated rats were used as controls. Calpain co-localized, co-fractionated, and co-immunoprecipitated with NCX1 in rat cardiomyocytes and left ventricle lysate. Immunoprecipitations, pull-down experiments, and extensive use of peptide arrays indicated that calpain domain III anchored to the first Ca2+ binding domain in NCX1, whereas the calpain catalytic region bound to the catenin-like domain in NCX1. The use of bioinformatics, mutational analyses, a substrate competitor peptide, and a specific NCX1-Met369 antibody identified a novel calpain cleavage site at Met369. Engineering NCX1-Met369 into a tobacco etch virus protease cleavage site revealed that specific cleavage at Met369 inhibited NCX1 activity (both forward and reverse mode). Finally, a short peptide fragment containing the NCX1-Met369 cleavage site was modeled into the narrow active cleft of human calpain. Inhibition of NCX1 activity, such as we have observed here following calpain-induced NCX1 cleavage, might be beneficial in pathophysiological conditions where increased NCX1 activity contributes to cardiac dysfunction