A convenient method to pre-screen candidate guide RNAs for CRISPR/Cas9 gene editing by NHEJ-mediated integration of a 'self-cleaving' GFP-expression plasmid.

The efficacies of guide RNAs (gRNAs), the short RNA molecules that bind to and determine the sequence specificity of the Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease, to mediate DNA cleavage vary dramatically. Thus, the selection of appropriate target sites, and hence spacer sequence, is critical for most applications. Here, we describe a simple, unparalleled method for experimentally pre-testing the efficiencies of various gRNAs targeting a gene. The method explores NHEJ-cloning, genomic integration of a GFP-expressing plasmid without homologous arms and linearized in-cell. The use of 'self- cleaving' GFP-plasmids containing universal gRNAs and corresponding targets alleviates cloning burdens when this method is applied. These universal gRNAs mediate efficient plasmid cleavage and are designed to avoid genomic targets in several model species. The method combines the advantages of the straightforward FACS detection provided by applying fluorescent reporter systems and of the PCR-based approaches being capable of testing targets in their genomic context, without necessitating any extra cloning steps. Additionally, we show that NHEJ-cloning can also be used in mammalian cells for targeted integration of donor plasmids up to 10 kb in size, with up to 30% efficiency, without any selection or enrichment

Mb- and FnCpf1 nucleases are active in mammalian cells

Cpf1s, the RNA-guided nucleases of the class II clustered regularly interspaced short palindromic repeats system require a short motive called protospacer adjacent motif (PAM) to be present next to the targeted sequence for their activity. The TTTV PAM sequence of As- and LbCpf1 nucleases is relatively rare in the genome of higher eukaryotic organisms. Here, we show that two other Cpf1 nucleases, Fn- and MbCpf1, which have been reported to utilize a shorter, more frequently occurring PAM sequence (TTN) when tested in vitro, carry out efficient genome modification in mammalian cells. We found that all four Cpf1 nucleases showed similar activities and TTTV PAM preferences. Our approach also revealed that besides their activities their PAM preferences are also target dependent. To increase the number of the available targets for Fn- and MbCpf1 we generated their RVR and RR mutants with altered PAM specificity and compared them to the wild-type and analogous As- and LbCpf1 variants. The mutants gained new PAM specificities but retained their activity on targets with TTTV PAMs, redefining RR-Cpf1's PAM-specificities as TTYV/TCCV, respectively. These variants may become versatile substitutes for wild-type Cpf1s by providing an expanded range of targets for genome engineering applications

Az Országos Bírósági Hivatal, mint a motiváció "motorja"

Szakdolgozatomban a motiváció területét veszem górcső alá. S a fogalmi és elméleti áttekintések után a bírói motiváció gyakorlatban megvalósítható lehetőségeit is igyekszem feltárni. Azért is tartom nagyon érdekesnek e terület, mert az igazságszolgáltatás funkcióját ellátó bírói hatalom a hatalmi ágak rendszerében a legfüggetlenebb. A függetlenség biztosításának célja az, hogy az igazságszolgáltatás pártatlan lehessen, más hatalmi ágaknak ne legyen lehetősége beavatkozni az igazságszolgáltatás folyamataiba. A pártatlan ítélkezés a jogállamiság egyik alapja; így óriási jelentőségű az, hogy nemcsak a szakma, hanem a társadalom tagjai felé is elhivatott bírói kar ítélkezzen. Ugyanakkor a bíró ítélkezésében nem utasítható. Ezáltal a bírói munka (a többi jogászi pályához hasonlóan, de) különösen olyan, hogy a felettese nem tud igazán beavatkozni, mivel azzal esetleg sértené a bírói függetlenséget, vagy annak látszatát, ami legalább annyira jelentős szempont. Erre tekintettel nagyon fontos a dolgozó szorgalma és lojalitása a szervezet iránt, mert munkája a felettesek számára közvetlenül sokkal nehezebben ellenőrizhető, mint az olyan munkaszervezetekben, ahol hierarchikus irányítás konkrétabban és szélesebb körben tud érvényesülni, például a közigazgatásban.szakirányú továbbképzésHR-szakjogás

A rendőri jelentés, mint bizonyítási eszköz a büntetőeljárásban

A bizonyítás a büntetőeljárás meghatározó, egyik legfontosabb intézménye, mely átszővi a büntetőeljárás nyomozási és bírósági szakaszát is. Dolgozatomban az okirati bizonyítékok körében értékelendő rendőri jelentést kívánom - durva kifejezéssel élve – górcső alá venni.egységes, osztatlanjogás

A convenient method to pre-screen candidate guide RNAs for CRISPR/Cas9 gene editing by NHEJ-mediated integration of a 'self-cleaving' GFP-expression plasmid

The efficacies of guide RNAs (gRNAs), the short RNA molecules that bind to and determine the sequence specificity of the Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease, to mediate DNA cleavage vary dramatically. Thus, the selection of appropriate target sites, and hence spacer sequence, is critical for most applications. Here, we describe a simple, unparalleled method for experimentally pre-testing the efficiencies of various gRNAs targeting a gene. The method explores NHEJ-cloning, genomic integration of a GFP-expressing plasmid without homologous arms and linearized in-cell. The use of 'self- cleaving' GFP-plasmids containing universal gRNAs and corresponding targets alleviates cloning burdens when this method is applied. These universal gRNAs mediate efficient plasmid cleavage and are designed to avoid genomic targets in several model species. The method combines the advantages of the straightforward FACS detection provided by applying fluorescent reporter systems and of the PCR-based approaches being capable of testing targets in their genomic context, without necessitating any extra cloning steps. Additionally, we show that NHEJ-cloning can also be used in mammalian cells for targeted integration of donor plasmids up to 10 kb in size, with up to 30% efficiency, without any selection or enrichment