Jak/Stat-signaling in function and developmentof normal and malignant hematopoiesis with focus on leukemic stem cells

(i) Eine der zentralsten Fragen der Krebsforschung lautet, ob die Entwicklung eines Tumors durch selten vorkommende Krebs-Stammzellen verursacht wird. Zurzeit herrscht Unklarheit darüber, ob dieses Modell oder das Modell der klonalen Evolution von Tumorzellen der Wahrheit entspricht. Hier zeigen wir, dass beide Hypothesen wahr sein können, wenn man in Betracht zieht, dass Tumorzellen, die den Tumor erhalten, unterschiedlich von denen sind, die ihn initiieren. Wir haben akute lymphoide und chronisch myeloide Leukämien verglichen und entdeckten, dass die Tumor-initiierende und die Tumor-erhaltende Krebs-Stammzelle in myeloiden Leukämien zur ein und derselben Zellart gehört. In lymphoiden Leukämien hingegen ändert sich die Identität der Tumor-initiierenden Zelle zu einer andreren Krebs-Stammzelle, die den Tumor erhält. Dieser Befund ist essentiell, um den Mechanismus der Leukämie-Entwicklung zu verstehen und erklärt die Prävalenz der Onkogene für bestimmte hämatopoietische Linien. (ii) Das BCR/ABL Onkogen aktiviert viele verschiedene Signaltransduktionswege, u.a. auch den Stat5 Signalweg. Wir zeigen, dass Stat5 essentiell für die Erhaltung dieser Leukämie ist. Die Beseitigung von Stat5 in einer etablierten Leukämie konnte sowohl myeloide als auch lymphoide Leukämien heilen. Stat5 ist mitverantwortlich für das Überleben von leukämischen Zellen, da dessen Beseitigung zu einem G0/G1 Zellzyklus-Arrest und anschliessend zu Apoptose führt - sowohl in Imatinib-empfindlichen wie auch in Imatinib-resistenten Zellen. Daher ist Stat5 ein potentieller Kandidat für neue Therapien. (iii) Wir zeigen eine essentielle Funktion von Stat5 in der EpoR/Jak2/Stat5-Achse in der erythroiden Entwicklung. Wir konnten zeigen, dass die Überexpression von Stat5 in Jak2- und EpoR-defizienten erythroiden Zellen die Erythropoiese in vitro retten kann. Das Einbringen einer konstitutiv-aktiven Stat5-Mutante (cS5F) in Jak2-/- foetalen Leberzellen konnte sowohl die Erythropoiese als auch die Myelopoiese retten. (iv) Im Gegensatz zu der erwarteten Rolle von Stat1 als Tumor-Suppressor, beschreiben wir eine Tumor-fördernde Rolle für Stat1 in MPD und lymphoider Leukämie. Stat1-/- Zellen exprimieren geringe Mengen an MHC Klasse I Molekülen an der Zelloberfläche und werden daher von NK-Zellen besser erkannt und eliminiert. Wir konnten weiters zeigen, dass Stat1-/-Tumorzellen in der Lage waren, höhere MHC Klasse I Expression zu erlangen - was ein allgemeiner Mechanismus für das Entkommen hämatopoietischer Tumoren vor dem Immunsystem sein könnte. (v) Wir zeigen eine essentielle Rolle für Stat5 in der lymphoiden Entwicklung und in lymphoider Leukämie. Stat5 ist erforderlich für die Entwicklung von CD8+ T-Zellen, von B-Zellen und γδ T-Zellen. Aufgrund der Beeinträchtigung der B-Zell-Entwicklung im Pre-Pro-B-Zellstadium, war die initiale Transformation mit Abelson-Onkogenen in vitro und in vivo völlig verhindert. Dies ist die erste Beschreibung von Stat5 als bedeutender Faktor in normaler Hämatopoiese und Leukämie

Clusterin Regulates Drug-Resistance in Melanoma Cells

Clusterin has recently been shown to act as an antiapoptotic protein that confers drug-resistance in models of epithelial tumors. The aim of our work was to provide an insight into a possible role of clusterin in the regulation of drug-resistance in melanoma. In tissue samples, clusterin expression was low in nevi, but high in primary melanoma and melanoma metastases. Clusterin was also strongly expressed in melanoma cell lines, but was barely detectable in cultured melanocytes. To elucidate a possible role of clusterin in drug-resistance of melanoma, clusterin expression was regulated by either plasmid-driven overexpression or by antisense-mediated downregulation. Clusterin overexpression was associated with an increase in drug-resistance, i.e., with an increased survival of melanoma cells in the presence of cytotoxic drugs. In contrast, downregulation of clusterin by 2′-O-(2-methoxy)ethyl (2′MOE)-modified antisense oligonucleotides (AS-ODN) directed against clusterin mRNA significantly reduced drug-resistance, i.e., decreased survival of melanoma cells in the presence of cytotoxic drugs. To evaluate the effects of clusterin-antisense treatment in vivo, we applied an SCID-mouse/human-melanoma xenotransplantation model. Pre-treatment of mice with the 2′MOE-modified clusterin AS-ODN was associated with a significantly improved tumor response to dacarbazine as compared with animals pretreated with a scrambled control oligonucleotide. Taken together, we show that clusterin is strongly expressed in melanoma. Downregulation of clusterin reduces drug-resistance, i.e., reduces melanoma cell survival in response to cytotoxic drugs in vitro and in vivo. Thus, reducing clusterin expression may provide a novel tool to overcome drug-resistance in melanoma

RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1

The 5′ untranslated region (UTR) of retroviruses contain structured replication motifs that impose barriers to efficient ribosome scanning. Two RNA structural motifs that facilitate efficient translation initiation despite a complex 5′ UTR are internal ribosome entry site (IRES) and 5′ proximal post-transcriptional control element (PCE). Here, stringent RNA and protein analyses determined the 5′ UTR of spleen necrosis virus (SNV), reticuloendotheliosis virus A (REV-A) and human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) exhibit PCE activity, but not IRES activity. Assessment of SNV translation initiation in the natural context of the provirus determined that SNV is reliant on a cap-dependent initiation mechanism. Experiments with siRNAs identified that REV-A and HTLV-1 PCE modulate post-transcriptional gene expression through interaction with host RNA helicase A (RHA). Analysis of hybrid SNV/HTLV-1 proviruses determined SNV PCE facilitates Rex/Rex responsive element-independent Gag production and interaction with RHA is necessary. Ribosomal profile analyses determined that RHA is necessary for polysome association of HTLV-1 gag and provide direct evidence that RHA is necessary for efficient HTLV-1 replication. We conclude that PCE/RHA is an important translation regulatory axis of multiple lymphotropic retroviruses. We speculate divergent retroviruses have evolved a convergent RNA–protein interaction to modulate translation of their highly structured mRNA

Conditional Stat1 Ablation Reveals the Importance of Interferon Signaling for Immunity to Listeria monocytogenes Infection

Signal transducer and activator of transcription 1 (Stat1) is a key player in responses to interferons (IFN). Mutations of Stat1 cause severe immune deficiencies in humans and mice. Here we investigate the importance of Stat1 signaling for the innate and secondary immune response to the intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes (Lm). Cell type-restricted ablation of the Stat1 gene in naïve animals revealed unique roles in three cell types: macrophage Stat1 signaling protected against lethal Lm infection, whereas Stat1 ablation in dendritic cells (DC) did not affect survival. T lymphocyte Stat1 reduced survival. Type I IFN (IFN-I) signaling in T lymphocytes reportedly weakens innate resistance to Lm. Surprisingly, the effect of Stat1 signaling was much more pronounced, indicating a contribution of Stat1 to pathways other than the IFN-I pathway. In stark contrast, Stat1 activity in both DC and T cells contributed positively to secondary immune responses against Lm in immunized animals, while macrophage Stat1 was dispensable. Our findings provide the first genetic evidence that Stat1 signaling in different cell types produces antagonistic effects on innate protection against Lm that are obscured in mice with complete Stat1 deficiency. They further demonstrate a drastic change in the cell type-dependent Stat1 requirement for memory responses to Lm infection

Lag om kvalificerade elektroniska signaturer : -verkningslös eller uppfyller den sitt syfte?

Sammanfattning Elektronisk handel har under senare år vuxit fram som ett av de potentiellt mest betydelsefulla användningsområdena för den moderna informations- och kommunikationstekniken. Genom lag (2000:832) om kvalificerade elektroniska signaturer, implementerades EG-direktivet (1999/93), om ett gemenskapsverk för elektroniska signaturer. Det övergripande syftet med direktivet har varit att samordna medlemsstaternas tekniska och juridiska arbete vad gäller elektroniska signaturer. Kommisionens mål var att underlätta användningen av elektroniska signaturer och bidra till ett rättsligt erkännande av dessa, främst för att undanröja eventuella hinder mot elektronisk handel. Syftet med uppsatsen har varit att ta reda på om svensk lagstiftning på området, lagen om kvalificerade elektroniska signaturer, har underlättat användningen av elektroniska signaturer. Anslutningsvis kan man påpeka att lagens rättsliga skyddsmekanismer och dess tillsyn, samt det skadeståndsansvar som lagen reglerar, endast tillämpas om det är fråga om kvalificerade elektroniska signaturer som är baserade på kvalificerade certifikat, och som utfärdas till allmänheten. Har den kvalificerade elektroniska signaturen då underlättat användningen av elektroniska signaturer? Slutsatsen som kan dras är att den kvalificerade elektroniska signaturen inte har underlättat en användning av elektroniska signaturer, vare sig på den privata marknaden eller inom den offentliga sektorn, då det för närvarande inte finns någon certifikatutfärdare anmäld hos tillsynsmyndigheten Post-och Telestyrelsen. Vilka anledningar till detta kan man då finna? Det finns flera troliga orsaker till att lagen inte har fått det genomslag som ändå måste ha förväntats av denna. Lagstiftningen är till en början komplex. Den kräver en tillsyn av certifikatutfärdaren samtidigt som den innehåller tvingande skadeståndsregler gentemot den eller de, som förlitat sig på certifikatet och som åsamkats skada. Även begreppet ”till allmänheten” är otydligt och kräver en vidare utredning. Marknaden verkar inte vara i behov av den kvalificerade elektroniska signaturen med det regelverk som uppställs. Denna verkar ha gått andra vägar för att hitta lösningar för den elektroniska handeln och annan elektronisk kommunikation. Vidare uppställs det ibland formkrav i svenska författningar och förordningar då endast egenhändiga underskrifter accepteras. Dessa formkrav utgör ett rättsligt hinder när en underskrift skall signeras elektroniskt, om formkraven utesluter elektroniska signaturer. I syftet ställs även frågan om det överhuvudtaget finns ett behov av en lagstiftning på området, då lagen uppenbarligen inte tillämpas. Då det finns formkrav i lagar och andra författningar på egenhändig underskrift, finns det ett behov av att reglera vilken form av elektronisk signatur som skall kunna tillgodose kravet på en traditionell namnteckning. Därav torde en lagstiftning vara nödvändig. I uppsatsen behandlas också frågan om behovet av möjliga reformåtgärder. Här ges förslaget att man istället skall använda sig av FN:s modellag om elektroniska signaturer. Modellagens elektroniska signatur betonar avsikten med den elektroniska underskriften, vilket ger den en starkare rättslig ställning, utan att kräva den komplexa svenska lagstiftningen. Någon sådan definitionsmässig avsikt har inte den kvalificerade signaturen enligt svensk lagstiftning. Samtidigt ges förslaget att bestämmelsen som utesluter elektroniska signaturer, då formkrav i annan lag kräver egenhändig underskrift, möjligen borde tas bort. Då den elektroniska signaturen enligt FN:s modell även syftar till att ett nytt kommunikationssätt bör omfattas av det gamla regelverket, bör en sådan elektronisk signatur uppfylla kravet på en traditionell namnunderskrift

Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Activation Promotes Invasive Growth of Colon Carcinomas through Matrix Metal loproteinase Induction

AbstractSignal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is aberrantly activated in colorectal carcinomas (CRCs). Here, we define the relationship between STAT3 function and the malignant properties of colon carcinoma cells. Elevated activation of STAT3 enhances invasive growth of the CRC cell lines. To address mechanisms through which STAT3 influences invasiveness, the protease mRNA expression pattern of CRC biopsies was analyzed and correlated with the STAT3 activity status. These studies revealed a striking coincidence of STAT3 activation and strong expression of matrix metalloproteinases MMP-1, -3, -7, and -9. Immunohistological examination of CRC tumor specimens showed a clear colocalization of MMP-1 and activated STAT3. Experimentally induced STAT3 activity in CRC cell lines enhanced both the level of MMP-1 mRNA and secreted MMP-1 enzymatic activity. A direct connection of STAT3 activity and transcription from the MMP-1 promoter was shown by reporter gene experiments. Moreover, high-affinity binding of STAT3 to STAT recognition elements in both the MMP-1 and MMP-3 promoter was demonstrated. Xenograft tumors arising from implantation of CRC cells into nude mice showed simultaneous appearance and colocalization of p-Y-STAT3 and MMP-1 expression. Our results link aberrant activity of STAT3 in CRC to malignant tumor progression through upregulated expression of MMPs