«Το κοντσέρτο για πιάνο και ορχήστρα μετά τον Beethoven και μέχρι το τέλος του 19ου αιώνα. Ζητήματα ενορχήστρωσης»

Με τον όρο κοντσέρτο αναφερόμαστε σε μια μουσική σύνθεση η οποία περιλαμβάνει μια αντιπαράθεση μεταξύ ενός ορχηστρικού συνόλου και μιας μικρότερης ομάδας οργάνων ή ενός σόλο οργάνου είτε ακόμη και μεταξύ διαφορετικών ομάδων οργάνων μέσα στην ίδια ορχήστρα. Πριν το 1700 ο όρος αυτός χρησιμοποιούνταν για να χαρακτηρίσει πολλά διαφορετικά μουσικά κομμάτια που προορίζονταν τόσο για φωνές όσο και για όργανα. Επίσης την εποχή εκείνη με τον όρο αυτό αναφέρονταν και σε μουσικές συνθέσεις για μικρά σύνολα ή για ορχήστρα. Από τις αρχές του 18ου αιώνα ξεκίνησε η συστηματική χρήση του όρου για να περιγράψει έργα με τριμερή μορφή (γρήγορο-αργό-γρήγορο) για ένα ή περισσότερα σόλο όργανα και ορχήστρα (κοντσερτο γκρόσο) ή για ολόκληρη ορχήστρα. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάλυση ορισμένων χαρακτηριστικών πιάνο κοντσέρτων των σημαντικότερων συνθετών του 19ου αιώνα που εμφανίστηκαν μετά από τον Beethoven. Συγκεκριμένα, θα σχολιαστούν παρακάτω τα έργα των Johannes Brahms, Eduard Grieg, Robert Schumann, Pyotr Tchaikovsky, Franz Liszt και Frédéric Chopin. Στις δεκαετίες που ακολούθησαν μετά από το θάνατο του Beethoven, τα κοντσέρτα επηρεάστηκαν από την υπεροχή του δεξιοτέχνη συνθέτη-ερμηνευτή στα ορχηστρικά δρώμενα. Ένας βασικός παράγοντας που καθόρισε το πιάνο κοντσέρτο ως είδος τον 19ο αιώνα ήταν η ανάγκη για επαναπροσδιορισμό των ορίων δεξιοτεχνίας. Για το λόγο αυτό θα συζητηθεί παρακάτω ποιος είναι ο ρόλος του σόλου οργάνου και ποιος ο ρόλος της ορχήστρας και θα αναλυθεί ο τρόπος με τον οποίο ο κάθε συνθέτης πραγματώνει την συνδιαλλαγή σόλο οργάνου και ορχήστρας. Τέλος, θα δοθεί ιδιαίτερη βαρύτητα στο ενορχηστρωτικό πλαίσιο στο οποίο κινείται ο κάθε συνθέτης και συγκεκριμένα ποια ομάδα οργάνων επιλέγει για να μεταχειριστεί το εκάστοτε θεματικό υλικό.The term concerto refers to an instrumental work that maintains contrast between an orchestral ensemble and a smaller group or a solo instrument, or among various groups of an undivided orchestra. Before 1700 the term was applied to pieces in a variety of forms for an even greater variety of performing media, voices as well as instruments. It was also used in the sense of ‘ensemble’ or ‘orchestra’. Not until the beginning of the 18th century was it applied consistently (though not exclusively) to works in three movements (fast–slow–fast) for soloist and orchestra, two or more soloists and orchestra (concerto grosso) or undivided orchestra. The purpose of the present thesis is to analyze some characteristic piano concerti composed by the most important composers of the 19th century that appeared after Beethoven. Specifically, the works of Johannes Brahms, Eduard Grieg, Robert Schumann, Pyotr Tchaikovsky, Franz Liszt and Frédéric Chopin will be commented on below. In the decades following Beethoven's death, the concerti were influenced by the superiority of the skillful composer-performer in the orchestral acting. A key factor determining the piano concerto as a genre in the 19th century was the need to redefine the limits of virtuosity. Therefore, we will discuss the role of the solo instrument and that of the orchestra, and comment on the interaction between them. Finally, we will focus on the orchestration context in which each composer moves, and specifically which group of instruments chooses each composer to treat the thematic material

Isolation of fetal ceus from maternal blood: possibilities for non-invasive prenatal diagnosis

Isolation of fetal cells from maternal peripheral blood during pregnancy gives today new possibilities to the development of reliable and safe non - invasive prenatal testing, which can be offered to all women, regardless of their age or risk of having a child with chromosomal abnormality. Nucleated Red Blood Cells (NRBCs) are the fetal cells of choice, since they are abundant in first trimester fetal blood, mononuclear and have a full complement of nuclear genes, a distinctive morphology and limited life span. However, their rarity and the lack of specific markers that distinguish them from the maternal ones, hamper their successful isolation. The aim of the present study was the improvement and standardization of techniques for a non – invasive prenatal testing from fetal NRBCs isolated from maternal peripheral blood. 1. Different methods of NRBC enrichment from maternal peripheral blood and two monoclonal antibodies to the transferring receptor, in various combinations, were investigated in order to determine the combination with which the maximum number of fetal NRBCs is retrieved with minimal maternal cell contamination. 2. Use of fetal NRBCs isolated from maternal blood for non - invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies was evaluated. Twenty ml of peripheral blood were collected from 568 women in the 2nd trimester of pregnancy: 513 women carried chromosomally normal fetuses, 26 had chromosomally abnormal fetuses (trisomy 21: n=18, trisomy 18: n=2, trisomy 13: n=1, mosaic for trisomy 12: n=1, 47,XXX: n=1 and 45,XO: n=3) and 29 samples were obtained from pregnant women, carriers of β-thalassemia trait, known to carry chromosomally normal fetuses. For NRBC enrichment, density gradient centrifugation with Histopaque 1083gr/ml was performed, followed by magnetic activated cell sorting (MACS) using two monoclonal antibodies to the transferrin receptor, conjugated and non - conjugated with magnetic beads, which recognize different epitopes of the receptor. Isolated NRBCs were then stained with May-Grunwald/Giemsa and enumerated using morphological criteria by a light microscope. 190 samples coming from women carrying chromosomally normal fetuses were used for the standardization of the method. Isolation of NRBCs from maternal peripheral blood using a combination of negative and positive selection was compared to positive selection only. The average number of isolated NRBCs after positive selection was higher than that isolated after negative and positive selection (7 against 6) and positive selection was used for the isolation of NRBCs from the remaining samples. Next, the two monoclonal antibodies to the transferring receptor, the commercially available CD71 and 2F6.3 in conjugated and non – conjugated with magnetic beads form were compared. The average number of isolated NRBCs with commercially available CD71 was 6.52 (range 2 – 26) versus 4.04 (range 2 – 14) with non – conjugated 2F6.3. The average number of isolated NRBCs with commercially available CD71 was 7.04 (range 2 – 28) against 5.96 (range 2 – 20) with conjugated 2F6.3. For this reason, commercially available CD71 was used for the isolation of NRBCs from the remaining samples. NRBCs were detected in 475/568 (84%) of the samples tested. Among 416 women with chromosomally normal fetuses, 7 (range 6.52 – 7.5) NRBCs were identified. In 4 cases with normal karyotype an average of 104 (range 77 – 120) NRBCs were isolated, possibly due to the disruption of haemopoiesis in the mother or the random liberation of NRBCs at the time of sampling. In 29 pregnant women carriers of β-thalassemia trait with chromosomally normal fetuses, the mean number of isolated NRBCs was 61 (range 22 – 158). Among 26 women with chromosomally abnormal fetuses, the mean number of isolated NRBCs was 33.5 (range 5 – 113): in 18 cases with a trisomy 21 fetus the mean number was 66 (range 22 – 113), in two pregnancies with a trisomy 18 fetus it was 6 (range 5 – 7) and in one pregnancy with a trisomy 13 fetus it was 37. Eight NRBCs were isolated from the blood of a woman carrying a fetus with mosaic trisomy 12. The average number of isolated NRBCs in 3 pregnancies with a Turner syndrome fetus was 51 (range 43 – 58) and in one woman with a 47,XXX fetus it was 12. FISH was performed in 95 cases where more than 5 NRBCs were identified. In 70 samples from women with chromosomally normal fetuses, FISH was performed in order to determine the fetal sex using X and Y chromosome specific probes and in 25 samples (7 from high risk pregnancies for trisomy 21 and 18 from pregnancies with a trisomy 21 fetus) FISH was performed for the detection of both fetal sex and aneuploidy using X and 21 chromosome specific probes. Hybridization was successful in 70/95 (74%) samples. Fetal sex was correctly determined in 67/70 (96%) cases. In all instances with trisomy 21 the aneuploidy was confirmed and in high risk pregnancies it was excluded. The present study confirms the difficulty of enrichment and FISH analysis on NRBCs isolated from maternal blood due to the lack of specific monoclonal antibodies for their recognition and their apoptotic status. At the same time, it confirms that fetal cells can be isolated from maternal circulation with a magnetic cell sorter and used for the determination of fetal sex and trisomy 21, which is the most common viable fetal aneuploidy. Of significant interest is the increased number of NRBCs in maternal blood in pregnancies with some chromosomal abnormalities which can serve as an additional screening marker for fetal aneuploidies. However, the finding of increased number of NRBCs in women carriers of β-thalassemia trait known to carry chromosomally normal fetuses, as wells as, in almost 1% of pregnancies carrying chromosomally normal embryos could lead to wrong results. Therefore, the above non – invasive technique could be used as an alternative method for identifying the possibility of fetal aneuploidies as long as the anemic status of the mother is taken into consideration.Η απομόνωση εμβρυϊκών κυττάρων από το περιφερικό αίμα της εγκύου κατά τη διάρκεια της κύησης δίνει νέες δυνατότητες ανάπτυξης αξιόπιστων και ασφαλών μεθόδων μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν από όλες τις εγκύους, ανεξαρτήτως ηλικίας ή αντικειμενικού κινδύνου που έχουν να αποκτήσουν παιδί με χρωμοσωμική ανωμαλία. Από τους διάφορους τύπους των εμβρυϊκών κυττάρων που μπορούν να ανιχνευτούν στη μητρική κυκλοφορία, τα εμβρυϊκά εμπύρηνα ερυθρά κύτταρα (NRBCs) θεωρούνται τα πλέον κατάλληλα, γιατί αφθονούν στο εμβρυϊκό αίμα κατά το 1ο τρίμηνο, είναι μονοπύρηνα, έχουν πλήρη χρωμοσωμική σύσταση, χαρακτηριστική μορφολογία και μικρό χρόνο ζωής. ΄Ομως, η σπανιότητα των εμβρυϊκών NRBCs στο περιφερικό αίμα της εγκύου και η έλλειψη πολύ ειδικών δεικτών που να τα ξεχωρίζουν από τα μητρικά που τα περιβάλλουν, παρεμποδίζουν προς το παρόν τουλάχιστον τη χρησιμοποίησή τους στην κλινική πράξη. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η βελτίωση και προτύπωση μεθόδου μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου από εμβρυϊκά NRBCs που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα της εγκύου. Για το λόγο αυτό: 1. Αξιολογήθηκαν διαφορετικοί τρόποι εμπλουτισμού του περιφερικού αίματος της εγκύου σε NRBCs και δύο μονοκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν τον υποδοχέα της τρανσφερίνης σε διάφορους συνδυασμούς, ώστε να βρεθεί ο συνδυασμός εκείνος με τον οποίο απομονώνεται ο μεγαλύτερος αριθμός εμβρυϊκών NRBCs, ενώ ταυτόχρονα ελαττώνονται οι μητρικές προσμίξεις. 2. Εκτιμήθηκε η δυνατότητα προγεννητικής διάγνωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών του εμβρύου από εμβρυϊκά NRBCs που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα της εγκύου. Μελετήθηκαν συνολικά 568 δείγματα περιφερικού αίματος εγκύων στο 2ο τρίμηνο της κύησης (20ml σε EDTA): 513 δείγματα προήλθαν από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, 26 δείγματα από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα με χρωμοσωμικές ανωμαλίες (τρισωμία 21: n=18, τρισωμία 18: n=2, τρισωμία 13: n=1, μωσαϊκό τρισωμίας 12: n=1, 47,ΧΧΧ: n=1, 45,XO: n=3) και 29 δείγματα ελήφθησαν από εγκύους φορείς β - μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία. Ο εμπλουτισμός του περιφερικού αίματος της εγκύου σε NRBCs έγινε με φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας με Histopaque 1083gr/ml και μαγνητικό διαχωρισμό MACS με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης, άμεσα και έμμεσα σημασμένων με μαγνητικά σφαιρίδια, τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικούς επιτόπους του υποδοχέα. Τα NRBCs που απομονώθηκαν από τη μητρική κυκλοφορία, ταυτοποιήθηκαν με μορφολογικά κριτήρια σε οπτικό μικροσκόπιο μετά από αιματολογική χρώση May - Grunwald/Giemsa. 190 δείγματα που ελήφθησαν από εγκύους που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία χρησιμοποιήθηκαν για την προτύπωση της μεθόδου. Έγινε σύγκριση της δυνατότητας απομόνωσης NRBCs από το περιφερικό αίμα της εγκύου με συνδυασμό αρνητικής και θετικής επιλογής σε σχέση με τη θετική επιλογή. Ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε μετά από θετική επιλογή ήταν μεγαλύτερος από αυτόν που απομονώθηκε μετά από το συνδυασμό αρνητικής και θετικής επιλογής (7 έναντι 6). Για το λόγο αυτό, στα υπόλοιπα δείγματα η απομόνωση των NRBCs έγινε μόνο με θετική επιλογή. Στη συνέχεια, συγκρίθηκαν τα δύο μονοκλωνικά αντισώματα για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης, το εμπορικά διαθέσιμο CD71 και το 2F6.3, τόσο σε σημασμένη όσο και σε μη σημασμένη μορφή. Διαπιστώθηκε ότι ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε με το εμπορικά διαθέσιμο CD71 ήταν 6.52 (εύρος 2 – 26) έναντι 4.04 (εύρος 2 – 14) με το μη σημασμένο 2F6.3, καθώς επίσης ότι ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε με το εμπορικά διαθέσιμο CD71 ήταν 7.04 (εύρος 2 – 28) έναντι 5.96 (εύρος 2 – 20) με το σημασμένο με μαγνητικά σφαιρίδια 2F6.3, γι’ αυτό το εμπορικά διαθέσιμο CD71 χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για απομόνωση των NRBCs από τα υπόλοιπα 378 δείγματα. NRBCs απομονώθηκαν συνολικά σε 475/568 (84%) δείγματα. Σε 416 εγκύους με έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, ο μέσος αριθμός NRBCs ήταν 7 (εύρος 6.52 – 7.5). Σε 4 περιπτώσεις με φυσιολογικό καρυότυπο, ο μέσος αριθμός NRBCs ήταν 104 (εύρος 77 – 120), πιθανώς λόγω διαταραχής της αιμοποίησης στη μητέρα ή τυχαίας απελευθέρωσης NRBCs τη στιγμή της αιμοληψίας. Σε 29 εγκύους φορείς β-μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία, ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν 61 (εύρος 22 – 158). Σε 26 περιπτώσεις με ανευπλοειδή έμβρυα, ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν 33.5 (εύρος 5 - 113): σε κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21 ήταν 66 (εύρος 22 - 113), στις δύο κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 18 ήταν 6 (εύρος 5 - 7) και στην κύηση με έμβρυο με τρισωμία 13 ήταν 37. 8 NRBCs απομονώθηκαν από την κύηση με έμβρυο με μωσαϊκό τρισωμίας 12. Ο μέσος αριθμός NRBCs που απομονώθηκε στις τρεις κυήσεις με 45,ΧO έμβρυα ήταν 51 (εύρος 43 - 58) και στην κύηση με 47,XXX έμβρυο ήταν 12. Η τεχνική FISH εφαρμόστηκε σε 95 δείγματα περιφερικού αίματος εγκύων στα οποία ο αριθμός NRBCs που απομονώθηκε ήταν αρκετά μεγάλος (>5). Σε 70 δείγματα από κυήσεις εμβρύων χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία έγινε ανίχνευση του φύλου του εμβρύου χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές για τα χρωμοσώματα Χ και Υ και σε 25 δείγματα (7 από κυήσεις υψηλού κινδύνου για τρισωμία 21 και 18 από κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21) έγινε ανίχνευση τόσο του φύλου όσο και της ανευπλοειδίας του εμβρύου, χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές για τα χρωμοσώματα Χ και 21. Ο υβριδισμός ήταν επιτυχής σε 70/95 (74%) δείγματα. Το φύλο του εμβρύου καθορίστηκε σωστά σε 67/70 (96%) δείγματα. Η τρισωμία 21 επιβεβαιώθηκε στα 18 δείγματα που προέρχονταν από κυήσεις εμβρύων με τρισωμία 21 και αποκλείστηκε στα 7 δείγματα που προέρχονταν από κυήσεις υψηλού κινδύνου. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει τη δυσκολία απομόνωσης και μελέτης των NRBCs με FISH κυρίως λόγω της έλλειψης ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων που να διευκολύνουν την απομόνωσή τους, αλλά και του αποπτωτικού τους χαρακτήρα. Ταυτόχρονα όμως, επιβεβαιώνει ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα μπορούν να απομονωθούν κατά τη διάρκεια της κύησης με μαγνητικό διαχωρισμό και να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό του φύλου και της τρισωμίας 21 του εμβρύου, που αποτελεί την πιο κοινή βιώσιμη ανευπλοειδία. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ο αυξημένος αριθμός των NRBCs στη μητρική κυκλοφορία σε κυήσεις εμβρύων με ορισμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες, ο οποίος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν επιπλέον δείκτης πληθυσμιακού ελέγχου. Η διαπίστωση όμως αυξημένου αριθμού NRBCs σε εγκύους φορείς β – μεσογειακής αναιμίας που κυοφορούσαν έμβρυα χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία καθώς και σε 1% περίπου κυήσεων εμβρύων χωρίς χρωμοσωμική ανωμαλία μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. Επομένως, η μη επεμβατική τεχνική που μελετήθηκε θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μια εναλλακτική μέθοδος για την ταυτοποίηση φυσιολογικών και μη εμβρύων, αρκεί η κατάσταση αναιμίας της μητέρας να λαμβάνεται υπόψιν

Study of the role of proteoglycans and glycosaminoglycans in fibrosarcoma cell functions and investigation of the role of growth factors

Fibrosarcoma is a rare malignant tumor originating from fibroblasts. Different cell lines of fibroblastic origin have been shown to have an abundant ECM with a high content and turnover of hyaluronan (HA) and proteoglycans. HA modulates key cancer cell functions through interaction with its CD44 and receptor for hyaluronic acid-mediated motility (RHAMM) receptors. HA was recently found to regulate the migration of fibrosarcoma cells in a manner specifically dependent on its size. It is observed in neonates, in middle-aged and elderly and represents a 10-20% of tumors that occur in childhood. More than half of the patients die within 5 years. The treatment of choice is the excision of the tumor and chemotherapy. The causes of of this cancer type development remain unknown and its diagnosis is usually made by exclusion. The extracellular matrices (ECMs) are complicated structures that surround and support cells within tissues. The ECM acts as a physical scaffold to which tumor cells attach and migrate and thus is crucial for the regulation of cell motility, proliferation, invasion, and metastasis. HA, a glycosaminoglycan, is a ubiquitous component of the extracellular matrix that provides tissue homeostasis and is known to have a fundamental role in maintaining the ECM architecture.High levels of HA reported in tumor cells and peri-tumor stroma are suggested to be strong independent prognostic indicators of poor outcome in breast, ovarian, gastric, and colorectal cancers. In tumor cell microenvironment systems, HA is able to transmit signals originating from the ECM into the cell, and changes in its metabolism have been linked to the promotion of cell motility, adhesion, migration, and metastasis. Considerable evidence indicates that HA mediates these biological processes mostly via specific interactions with its receptors CD44 και RHAMM. CD44 is the best characterized HA receptor and is indicated to be the principal mediator of HA signaling. RHAMM receptor (receptor for hyaluronic acid-mediated motility) is unique among the hyaladherins due to its variable distribution on the cell surface, within the cytoplasm, in the nucleus, or secreted to the ECM. The process of cell adhesion including the molecules that are involved in it play a fundamental role in carcinogenesis. It has been reported that the reduction of adhesion forces between cells and between cell-extracellular matrix allows some cancer cells to separate from each other and detach from an initial tumor site to and to migrate into another (metastasis). An important molecule that is located in adhesion sites, focal adhesion kinase (FAK), induces the adhesive ability of the cells by activating intracellular signaling pathways. The activity of FAK is triggered by various molecules such as Src and ERK kinases that induce its phosphorylation.Moreover, carcinogenesis is a process characterized by deregulated cell proliferation with a simultaneous suppression of apoptosis leading to tumor formation and loss of tissue organization. The canonical Wnt signaling pathway regulates the expression of several fundamental genes that participate in crucial cellular functions such as proliferation, cell differentiation, and survival. The dysfunction of the Wnt cascade is associated with cancer pathogenesis in various tissues. An intracellular protein, β-catenin, is a crucial downstream mediator of the Wnt signaling cascade which can enhance carcinogenic events under pathological conditions. The β-catenin protein has the ability to induce cell proliferation by translocating to the nucleus where it upregulates the transcriptional activity of T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) and the expression of specific target genes, such as cyclin-D1, c-Jun and c-Myc. The aim of this study was to investigate HA/RHAMM interactions in the regulation of cell adhesion and proliferation of HT1080 fibrosarcoma cells. Moreover, we explored potential extracellular and intracellular signaling pathways that may regulate these specific cellular functions. Our ultimate goal was to identify new diagnostic markers for fibrosarcoma as well as target molecules suitable for the treatment of the disease.Initially, we investigated the effect of HA/RHAMM signaling on the ability of HT1080 fibrosarcoma cells to adhere onto fibronectin. Low molecular weight HA (LMWHA) significantly increased (p ≤ 0,01) the adhesion capacity of HT1080 cells, which high molecular weight HA inhibited. The ability of HT1080 RHAMM-deficient cells, but not of CD44-deficient ones, to adhere was significantly decreased (p ≤ 0,001) as compared to control cells. Importantly, the effect of LMWHA on HT1080 cell adhesion was completely attenuated in RHAMM-deficient cells. In contrast, adhesion of RHAMM-deficient cells was not sensitive to high molecular weight HA treatment, which identifies RHAMM as a specific conduit of the LMWHA effect. Western blot and real time-PCR analyses indicated that LMWHA significantly increased RHAMM transcript (p ≤ 0,05) and protein isoform levels (53%, 95 kDa; 37%, 73 kDa) in fibrosarcoma cells. Moreover, Western blot analyses showed that LMWHA in a RHAMM-dependent manner enhanced basal and adhesion-dependent ERK1/2 and focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation in HT1080 cells. Utilization of a specific ERK1/2 inhibitor completely inhibited (p ≤ 0,001) LMWHA-dependent adhesion, suggesting that ERK1/2 is a downstream effector of LMWHA/RHAMM signaling. Likewise, the utilization of the specific ERK1 inhibitor resulted in a strong down-regulation of FAK activation in HT1080 cells, which identifies ERK1/2 as a FAK upstream activator.Moreover, we investigated the effect of HA/RHAMM signaling on HT1080 fibrosarcoma cells proliferation. An in vitro proliferation assay showed that both low molecular weight ΗΑ and high molecular weight ΗΑ (HMWHA) significantly increased (p ≤ 0,01 and p ≤ 0,05 respectively) ΗΤ1080 cell proliferation. In order to investigate the direct role of RHAMM on HT1080 cell growth, we utilized siRNA specific for the RHAMM gene. The demonstrated increase of HT1080 cells’ proliferation (p ≤ 0,01) due to LMWHA was completely inhibited in siRHAMM-treated cells as compared with the siRHAMM controls. In an attempt to locate candidate molecules participating in HA/RHAMM signaling pathway, we examined factors regulating the expression of RHAMM. Specifically, with the use of a specific ERK1/2 inhibitor, both the basal and the LMWHA induced proliferation levels were reduced. These results show that ERK1/2 is a mediator of LMWHA/RHAMM signaling. Furthermore, the downregulation of RHAMM led to a significant reduction of β-catenin expression both in mRNA (p ≤ 0,05) and protein levels (p ≤ 0,01). Then, we examined the effect of β-catenin in fibrosarcoma cell proliferation. The downregulation of β-catenin caused a reduction in the basal levels as well as in the LMWHA induced fibrosarcoma cell proliferation. LMWHA altered significantly the β-catenin expression in mRNA (p ≤ 0,01) and protein levels (p ≤ 0,05). The addition of LMWHA resulted in an increase of β-catenin protein expression in the nucleus. Moreover, the downregulation of both β-catenin and RHAMM receptor caused a reduction of c-myc (p ≤ 0,001; p ≤ 0,01) and c-jun (p ≤ 0,001; p = statistically non significant) respectively, which are important modulators of the cell cycle.Our results suggest that RHAMM/HA interaction regulates fibrosarcoma cell adhesion via the activation of FAK and ERK1/2 signaling pathways. The present study also suggests that RHAMM is a novel β-catenin intracellular binding partner, protecting β-catenin from degradation and supporting the nuclear translocation of this key cellular mediator, which results in c-myc activation and enhanced fibrosarcoma cell growth. From the above, therefore, it can be inferred that the RHAMM receptor and LMWHA may pose an investigation field for obtaining useful conclusions which aim at promoting the receptor to a diagnostic marker and both LMWHA and RHAMM as potential target molecules for treating fibrosarcoma.Το ινοσάρκωμα αποτελεί μια σπάνια μορφή καρκίνου των μαλακών μορίων, που προέρχεται από τους ινοβλάστες. Παρατηρείται σε νεογνά, σε μεσήλικες και ηλικιωμένους και αποτελεί το 10-20 % των όγκων που εμφανίζονται στην παιδική ηλικία. Περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς πεθαίνουν σε διάστημα 5 ετών. Η θεραπεία επιλογής είναι αφαίρεση του όγκου και χημειοθεραπεία. Η κυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και η διάγνωσή του, αρκετές φορές γίνεται συνήθως με τον αποκλεισμό των άλλων τύπων σαρκώματος.Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία είναι μια σύνθετη δομική οντότητα, η οποία περιβάλλει και υποστηρίζει τα κύτταρα που απαρτίζουν τους ιστούς. Τα κύρια δομικά συστατικά της είναι το κολλαγόνο, οι γλυκοπρωτεΐνες, οι πρωτεογλυκάνες (PGs) και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs). Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελεί ένα φυσικό σκελετό για την κυτταρική προσκόλληση και είναι εξαιρετικά σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την διαφοροποίηση τους. Το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), μια μη-θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη υψηλού μοριακού βάρους, αποτελεί ένα από τα βασικά συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) και διατηρεί την ομοιόσταση των ιστών.Υψηλά επίπεδα HA που έχουν βρεθεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έχει προταθεί ότι αποτελούν σημαντικούς προγνωστικούς δείκτες μειωμένης επιβίωσης σε καρκίνους του μαστού, των ωοθηκών και του παχέος εντέρου. Στο μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων, το HA μεταδίδει σήματα από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία προς το εσωτερικό του κυττάρου και αλλαγές στο μεταβολισμό του οδηγούν σε αύξηση της κυτταρικής κινητικότητας, της προσκόλλησης, της μετανάστευσης και της μετάστασης. Σημαντικά ευρήματα καταδεικνύουν ότι το HA ρυθμίζει αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασής του με τους ειδικούς υποδοχείς του, CD44 και RHAMM.Ο CD44 είναι ο καλύτερα χαρακτηρισμένος υποδοχέας του HA και έχει δειχθεί ότι είναι ο κύριος ρυθμιστής του. Ο RHAMM (receptor for hyaluronic acid-mediated motility) διαφέρει απ’ τους υπόλοιπους υποδοχείς του HA λόγω του ότι εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα, στο πυρήνα καθώς επίσης και στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη. H διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης, και τα εμπλεκόμενα σε αυτή μόρια, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Έχει αναφερθεί ότι η ελάττωση των προσκολλητικών δυνάμεων μεταξύ των κυττάρων και μεταξύ κυττάρου-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας επιτρέπει σε μερικά καρκινικά κύτταρα να αποχωριστούν μεταξύ τους και να αποκολληθούν από την αρχική καρκινική εστία και να μεταναστεύσουν σε άλλο όργανο. Στα σημεία κυτταρικής προσκόλλησης εντοπίζεται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), η οποία επάγει την προσκολλητική ικανότητα των κυττάρων ενεργοποιώντας ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια. Η δράση της FAK ενεργοποιείται από διάφορα μόρια που επάγουν τη φωσφωρυλίωσή της, κάποια απ’ τα οποία είναι οι κινάσες Src και ERK. Η καρκινογένεση αποτελεί μια κυτταρική λειτουργία που χαρακτηρίζεται από τη διαταραχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με την ταυτόχρονη καταστολή της απόπτωσης με αποτέλεσμα το σχηματισμό όγκων. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση σημαντικών γονιδίων που συμμετέχουν σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η κυτταρική διαφοροποίηση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Έχει δειχθεί ότι η διαταραχή της λειτουργίας του Wnt σηματοδοτικού μονοπατιού έχει συσχετιστεί με την εμφάνιση καρκίνου σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Η β-catenin είναι μια πρωτεΐνη με πολλές λειτουργίες που συμμετέχει στο Wnt μονοπάτι διεγείροντας την κυτταρική αύξηση και ρυθμίζοντας λειτουργίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την καρκινογένεση. Η πρωτεΐνη αυτή έχει την ικανότητα να επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη μετατόπισή της στον πυρήνα. Ο ρόλος της εκεί είναι να ρυθμίζει τη μεταγραφική ικανότητα των T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) και πιο συγκεκριμένα να ενεργοποιεί γονίδια όπως η cyclin-D1, c-jun, c-myc. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της δράσης της HA/RHAMM αλληλεπίδρασης σε δύο βασικές κυτταρικές λειτουργίες, αυτές της προσκόλλησης και του πολλαπλασιασμού των HT1080 κυττάρων του ινοσαρκώματος. Επίσης βασιζόμενοι στη προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, διερευνήσαμε πιθανά εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια μονοπάτια σηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση των συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών. Απώτερος στόχος μας ήταν ο εντοπισμός νέων διαγνωστικών δεικτών για το ινοσάρκωμα καθώς και μορίων-στόχους κατάλληλων για τη θεραπευτική αντιμετώπισή του. Πιο συγκεκριμένα, στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάσαμε τη δράση της HA/RHAMM σηματοδότησης στην ικανότητα προσκόλλησης των HT1080 κυττάρων ινοσαρκώματος πάνω σε υπόστρωμα ινονεκτίνης. Το χαμηλού μοριακού βάρους HA (LMWHA), αύξησε σημαντικά την προσκολλητική ικανότητα των HT1080 κυττάρων, ενώ το υψηλού μοριακού βάρους HA τη μείωσε. Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων στα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM, μειώθηκε σημαντικά (p ≤ 0,001), ενώ σε αυτά που είχε ανασταλεί η έκφραση του CD44 δεν διαπιστώθηκε αλλαγή σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι η επίδραση του LMWHA στην κυτταρική προσκόλληση των ΗΤ1080 κυττάρων καταργήθηκε στα κύτταρα τα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM. Αντιθέτως, τα ίδια κύτταρα δεν έδειξαν καμία αλλαγή με την προσθήκη του υψηλού μοριακού βάρους HA, γεγονός που καταδεικνύει τον RHAMM σαν ένα εξειδικευμένο και απαραίτητο μόριο για τη δράση του LMWHA. Οι τεχνικές της ανοσοαποτύπωσης κατά Western και της PCR έδειξαν ότι το LMWHA αυξάνει σημαντικά την mRNA έκφραση του RHAMM (p ≤ 0,05) καθώς και τα επίπεδα πρωτεϊνικών ισομορφών του RHAMM (53% 45kDa, 95 kDa 37%, 73 kDa) σε κύτταρα ινοσαρκώματος. Επιπλέον, η ανοσοαποτύπωση κατά Western έδειξε ότι το LMWHA μέσω του RHAMM ενισχύει τόσο τα βασικά επίπεδα κυτταρικής προσκόλλησης όσο και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK1/2 και της κινάσης της προσκόλλησης (FAK). Με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προέκυψε πλήρης αναστολή (p ≤ 0,001) της δράσης του LMWHA στην προσκόλληση των κυττάρων, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Αντίστοιχα, με τη χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προκλήθηκε σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της FAK γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ενεργοποιητή της FAK.Στην συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της σηματοδότησης του ΗΑ, μέσω του RHAMM υποδοχέα του, στον πολλαπλασιασμό κυττάρων του ινοσαρκώματος. Μία in vitro δοκιμή πολλαπλασιασμού έδειξε ότι τόσο το χαμηλού μοριακού βάρους ΗΑ (LMWHA) όσο και το υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ (HMWHA) αύξησαν σημαντικά (p ≤ 0,01 και p ≤ 0,05 αντίστοιχα) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ1080. Προκειμένου να μελετηθεί ο άμεσος ρόλος του RHAMM στον επαγόμενο από το ΗΑ πολλαπλασιασμό των ΗΤ1080 κυττάρων, έγινε αναστολή της έκφρασης του RHAMM με χρήση RNA παρεμβολής (siRNA). Κύτταρα μετασχηματισμένα με siRHAMM έδειξαν σημαντική μείωση στο βασικό (p ≤ 0,01) και στον επαγόμενο από το LMWHA (p ≤ 0,001) ρυθμό ανάπτυξης. Στην προσπάθεια εντοπισμού υποψήφιων μορίων που συμμετέχουν στο ΗΑ/RHAMM μονοπάτι σηματοδότησης, εξετάστηκαν παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του RHAMM. Πιο συγκεκριμένα, με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 μειώθηκαν τόσο τα βασικά επίπεδα καθώς και ο επαγόμενος από το LMWHA πολλαπλασιασμός των κυττάρων του ινοσαρκώματος, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Στη συνέχεια, μετά από αναστολή του RHAMM μειώθηκε σημαντικά η έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,05) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,01). Έπειτα, εξετάστηκε η δράση της στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ινοσαρκώματος. Η αναστολή του γονιδίου της β-catenin οδήγησε σε αναμενόμενη μείωση τόσο των βασικών επιπέδων αλλά και του επαγόμενου από το LMWHA κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το LMWHA άλλαξε σημαντικά την έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,01) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,05). Πιο συγκεκριμένα, η προσθήκη LMWHA οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της β-catenin που εντοπίζεται στον πυρήνα. Ακόμη, μετά από αναστολή της έκφρασης της β-catenin καθώς και του RHAMM υποδοχέα μειώθηκε σημαντικά η έκφραση των γονιδίων c-myc (p ≤ 0,001; p ≤ 0,01) και c-jun (p ≤ 0,001; p = στατιστικά μη σημαντικό) αντίστοιχα, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.Με την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι η RHAMM/HA αλληλεπίδραση ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης των FAK και ERK1/2 μονοπατιών σηματοδότησης. Επίσης, τα δεδομένα που προκύπτουν αναδεικνύουν για πρώτη φορά την ύπαρξη μιας ενδοκυττάριας αλληλεπίδρασης του RHAMM με τη β-catenin η οποία οδηγεί στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα c-myc. Από τα παραπάνω λοιπόν, συνάγεται ότι ο RHAMM υποδοχέας και το LMWHA μπορούν να αποτελέσουν περαιτέρω πεδίο έρευνας για την άντληση χρήσιμων συμπερασμάτων που θα στοχεύουν στην ανάδειξη του υποδοχέα σε διαγνωστικό δείκτη και το LMWHA μαζί με RHAMM υποδοχέα ως πιθανά μόρια-στόχοι για τη θεραπευτική αντιμετώπιση του ινοσαρκώματος

Somatostatin -Dopamine interactions in rat retina

Η σωματοστατίνη αποτελεί ένα κυκλικό νευροπεπτίδιο με ποικίλες δράσεις στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Στον αμφιβληστροειδή η σωματοστατίνη εντοπίζεται κυρίως σε βραχύινα κύτταρα της εσωτερικής δικτυωτής στοιβάδας, καθώς επίσης και σε ορισμένους τύπους γαγγλιακών κυττάρων ή σε έκτοπα βραχύινα κύτταρα. Παρότι πρόσφατα έχει επιτευχθεί η λειτουργική χαρτογράφηση των υποδοχέων σωματοστατίνης (SSTR1-5), (Thermos 2003), ο ρόλος της παραμένει αδιευκρίνιστος. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες υποστηρίζουν τον συνεντοπισμό των υποδοχέων SSTR1 και SSTR2 με το ένζυμο υδροξυλάση της τυροσίνης, το περιοριστικό ένζυμο σύνθεσης της ντοπαμίνης, σε βραχύινα ντοπαμινεργικά κύτταρα. Η ντοπαμίνη είναι ένας από τους κύριους νευροτροποποιητές της οπτικής διαδικασίας και των κυκλωμάτων του αμφιβληστροειδούς. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης αφορά στην αποσαφήνιση του ρόλου της σωματοστατίνης ως ρυθμιστή της απελευθέρωσης ντοπαμίνης στον αμφιβληστροειδή αρουραίου. Χρησιμοποιήθηκαν αμφιβληστροειδείς οι οποίοι απομονώθηκαν από μάτια θηλυκών Sprague-Dawley αρουραίων, βάρους 250-280 gr και τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 οπών που περιείχαν θρεπτικό υλικό καλλιέργειας M-199. Ακολούθησε επώαση σε συνθήκες 95% αέρα και 5% CO2 στους 37o C, υπό ανάδευση, αρχικά για μια ώρα προκειμένου να επιτευχθεί σταθερή βασική έκκριση ντοπαμίνης από τους ιστούς. Στη συνέχεια κάθε 20 λεπτά πραγματοποιήθηκε συλλογή δείγματος από το υπερκείμενο της καλλιέργειας. Μετά από επεξεργασία των δειγμάτων με ενεργοποιημένη με θειϊκά όξινη αλούμινα, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση ντοπαμίνης στα δείγματα με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) σε συνδυασμό με ηλεκτροχημικό ανιχνευτή. Τα πρώτα τρία δείγματα (20-60 λεπτά) αποτέλεσαν τη βασική απελευθέρωση ντοπαμίνης. Στο τέταρτο δείγμα της καλλιέργειας γίνετε προσθήκη στο θρεπτικό υλικό της ουσίας επίδρασης [σωματοστατίνη 10-4, 10-5, 10 6 Μ, ΒΙΜ- 23014 (SSTR2 αγωνιστής) 10-4 και 10-5 Μ, CYN-154806 (SSTR2 ανταγωνιστής) 10-4 Μ-σωματοστατίνη 10-4 Μ, L-797.591 (SSTR1 αγωνιστής) 10-4 και 10-5 Μ), L-796.778 (SSTR3 αγωνιστής) 10-4 Μ], και ακολούθησε συλλογή άλλων 3 ή 4 δειγμάτων. Τα τρία πρώτα δείγματα σε κάθε πείραμα αποτέλεσαν τη βασική έκκριση ντοπαμίνης με την οποία συγκρίνονται τα επόμενα. Τα επίπεδα απελευθέρωσης ντοπαμίνης αυξήθηκαν κατά συγκεντρωσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά την επίδραση της σωματοστατίνης. Η αύξηση αυτή ήταν στατιστικά σημαντική συγκρινόμενη με τα επίπεδα της βασικής απελευθέρωσης. Η προσθήκη του ανταγωνιστή των SSTR2 υποδοχέων CYN-154806 στο θρεπτικό υλικό καλλιέργειας παράλληλα με την σωματοστατίνη, εμπόδισε την αύξηση των επιπέδων ντοπαμίνης, ενώ αντίθετα η επίδραση του ΒΙΜ-23014, εκλεκτικού αγωνιστή των SSTR2 υποδοχέων, εμφάνισε επίσης στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων απελευθέρωσης ντοπαμίνης. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων SSTR1 συντέλεσε επίσης στην αύξηση των επιπέδων ντοπαμίνης στον αμφιβληστροειδή, ενώ το εκλεκτικό προς τους SSTR3 υποδοχείς ανάλογο, δεν είχε καμία δράση. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν για πρώτη φορά ότι η σωματοστατίνη μέσω ενεργοποίησης των SSTR1 και SSTR2 υποδοχέων μπορεί να παίξει ρυθμιστικό ρόλο στην απελευθέρωση ντοπαμίνης στον αμφιβληστροειδή.Somatostatin is a cyclic neuropeptide, which mediate diverse actions in the central and peripheral nervous systems. In the retina, somatostatin is localized in amacrine cells in the inner plexiform layer, in displaced amacrines cells and in sοme types of ganglion cells. Five somatostatin receptor subtypes have been recently cloned, namely SSTR1-5 and their localization in the retina studied (Thermos, 2003). Yet, the role of somatostatin in the retina remains to be ascertained. Immunohistochemical studies support the colocalization of the SSTR1 and SSTR2 receptors with the enzyme tyrosine hydroxylase, the marker for dopamine, in amacrine dopaminergic cells. Dopamine is one of the major neuromodulators in visual processes and in retinal circuitry. The aim of the present study was to determine the possible role of somatostatin as a regulator of dopamine release in rat retina. Retinas from female Sprague-Dawley rats (250-280 g) were employed. Retinas were detached and placed in a 24 well-plate which contained M-199 medium and incubated in a culture incubator at 37 oC (95% air and 5% CO2) under shaking conditions for one hour in order to stabilize the release of dopamine from the tissues. Subsequently, samples were collected (medium) from the culture every 20 min. The samples were treated with acidic activated alumina and the concentration of dopamine in each sample determined by high performance liquid chromatography (HPLC), in combination with an electrochemical detector. The three first samples (20-60 minutes) represent the basal release of dopamine. In the fourth incubation, pharmacological agents were added [somatostatin (10-4, 10-5, 10 -6 Μ), or specific analogs ΒΙΜ-23014 (SSTR2 agonist, 10-4, 10-5 Μ), CYN-154806 (SSTR2 antagonist 10-4 Μ with somatostatin 10-4 Μ), L-797.591 (SSTR1 agonist, 10-4 and 10-5 Μ), L-796.778 (SSTR3 agonist, 10-4 Μ)], and three to four more samples collected. Somatostatin increased dopamine levels in a concentration-dependent manner. The increase was statistical significant as compared to the basal release. The addition of the SSTR2 antagonist CYN-154806 blocked the somatostatin induced increase of dopamine, while the SSTR2 agonist ΒΙΜ-23014 mimicked the somatostatin effect. Also the activation of SSTR1 receptors evoked increase of dopamine release, while activation of SSTR3 receptors had no effect. These results support for the first time a regulatory role for somatostatin in the release of dopamine in rat retina

Somatostatin modulates dopamine release in rat retina

The aim of the present study was to determine the possible role of somatostatin as a modulator of dopamine release in rat retina. Basal release of dopamine, and how this is influenced by somatostatin receptor (sst) selective ligands, was examined ex vivo in rat retinal explants. Dopamine levels were quantified by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection. Basal levels of dopamine were measured over 120 min of tissue incubation and found to be 1.17 ± 0.35 ng/ml. Somatostatin (10 -6, 10-5, 10-4 M) increased dopamine levels in a concentration-dependent manner, while the sst2 antagonist CYN154806 (10-4 M) reversed its actions. BIM23014 (sst2 agonist) increased dopamine levels in a statistically significant manner only at the concentration of 10-5 M. The sst1 agonist L797.591 (10-5, 10-4 M) also increased dopamine levels, while activation of the sst3 receptor (sst3 agonist, L796.778, 10-4 M) had no effect. These data substantiate a neuromodulatory role for sst1 and sst2 somatostatin receptors in the retina and show for the first time somatostatin's influence on dopamine release. © 2005 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved

The Roles of Hyaluronan/RHAMM/CD44 and Their Respective Interactions along the Insidious Pathways of Fibrosarcoma Progression

Fibrosarcomas are rare malignant mesenchymal tumors originating from fibroblasts. Importantly, fibrosarcoma cells were shown to have a high content and turnover of extracellular matrix (ECM) components including hyaluronan (HA), proteoglycans, collagens, fibronectin, and laminin. ECMs are complicated structures that surround and support cells within tissues. During cancer progression, significant changes can be observed in the structural and mechanical properties of the ECM components. Importantly, hyaluronan deposition is usually higher in malignant tumors as compared to benign tissues, predicting tumor progression in some tumor types. Furthermore, activated stromal cells are able to produce tissue structure rich in hyaluronan in order to promote tumor growth. Key biological roles of HA result from its interactions with its specific CD44 and RHAMM (receptor for HA-mediated motility) cell-surface receptors. HA-receptor downstream signaling pathways regulate in turn cellular processes implicated in tumorigenesis. Growth factors, including PDGF-BB, TGFβ2, and FGF-2, enhanced hyaluronan deposition to ECM and modulated HA-receptor expression in fibrosarcoma cells. Indeed, FGF-2 through upregulation of specific HAS isoforms and hyaluronan synthesis regulated secretion and net hyaluronan deposition to the fibrosarcoma pericellular matrix modulating these cells’ migration capability. In this paper we discuss the involvement of hyaluronan/RHAMM/CD44 mediated signaling in the insidious pathways of fibrosarcoma progression

Sequestrase chaperones protect against oxidative stress-induced protein aggregation and [PSI+] prion formation

Misfolded proteins are usually refolded to their functional conformations or degraded by quality control mechanisms. When misfolded proteins evade quality control, they can be sequestered to specific sites within cells to prevent the potential dysfunction and toxicity that arises from protein aggregation. Btn2 and Hsp42 are compartment-specific sequestrases that play key roles in the assembly of these deposition sites. Their exact intracellular functions and substrates are not well defined, particularly since heat stress sensitivity is not observed in deletion mutants. We show here that Btn2 and Hsp42 are required for tolerance to oxidative stress conditions induced by exposure to hydrogen peroxide. Btn2 and Hsp42 act to sequester oxidized proteins into defined PQC sites following ROS exposure and their absence leads to an accumulation of protein aggregates. The toxicity of protein aggregate accumulation causes oxidant sensitivity in btn2 hsp42 sequestrase mutants since overexpression of the Hsp104 disaggregase rescues oxidant tolerance. We have identified the Sup35 translation termination factor as an in vivo sequestrase substrate and show that Btn2 and Hsp42 act to suppress oxidant-induced formation of the yeast [PSI+] prion, which is the amyloid form of Sup35. [PSI+] prion formation in sequestrase mutants does not require IPOD (insoluble protein deposit) localization which is the site where amyloids are thought to undergo fragmentation and seeding to propagate their heritable prion form. Instead, both amorphous and amyloid Sup35 aggregates are increased in btn2 hsp42 mutants consistent with the idea that prion formation occurs at multiple intracellular sites during oxidative stress conditions in the absence of sequestrase activity. Taken together, our data identify protein sequestration as a key antioxidant defence mechanism that functions to mitigate the damaging consequences of protein oxidation-induced aggregation

Non-amyloid aggregate formation underlies the increased Sup35 aggregation observed in <i>btn2</i> hsp42 mutants.

A. [PSI+] prion formation was quantified in the wild-type, abp1, btn2 hsp42 and btn2 hsp42 abp1 mutant strains during non-stress conditions and following exposure to 0.8 mM hydrogen peroxide for one hour. Data shown are the means of at least three independent biological repeat experiments expressed as the number of colonies per 105 viable cells. Error bars denote standard deviation. Significance is shown using a one-way ANOVA test; * p p B. SDS-resistant Sup35 and Rnq1 aggregates were detected in the wild-type and btn2 hsp42 mutant strains using SDD-AGE. Strains were grown to exponential phase and left untreated (-) or treated with with 0.8 mM hydrogen peroxide (+) for one hour. [psi-] and rnq1 deletion strains are shown for comparison with Rnq1 and [PSI+] and [psi-] strains are shown for comparison with Sup35. Aggregate and monomer (M) forms are indicated. C. Representative epifluorescent microscopic images are shown from strains expressing Sup35-GFP or ΔN-Sup35-GFP. Strains were grown to exponential phase and left untreated (non-stress) or treated with with 0.8 mM hydrogen peroxide for one hour. Charts show the percentage of cells contain 0, 1–3, or >3 Sup35 puncta per cell scored in 300 cells for each strain. Significance: ** p p < 0.001 (Mann–Whiney U-test).</p

Hsp104 is required for oxidative stress tolerance in sequestrase mutants.

A. Representative epifluorescent microscopic images are shown from strains expressing Btn2-GFP or Hsp42-GFP and Hsp104-RFP. Strains were grown to exponential phase and left untreated or treated with with 0.8 mM hydrogen peroxide for one hour. Charts show the percentage of cells that contain 0, 1–3, or >3 Btn2, Hsp42 or Hsp104 puncta per cell scored in 300 cells for each strain. Significance is shown comparing stressed and unstressed strains; *** p B. Quantification is for the co-localisation (%) of Btn2 or Hsp42 puncta with Hsp104 puncta from three biological replicates. Error bars denote SD and significance is shown compared with the untreated strains, * p C. Overexpression of Hsp104 improves the hydrogen peroxide sensitivity of btn2 hsp42 mutants. The wild-type and btn2 hsp42 mutant strains containing vector control or expressing HSP104 under the control of the constitutive TDH3 promoter were grown to exponential phase and the A600 adjusted to 1, 0.1, 0.01 or 0.001 before spotting onto SD plates containing the indicated concentrations of hydrogen peroxide. Representative images are shown from repeat experiments D. Protein aggregates were isolated from the wild-type and btn2 hsp42 mutant strains containing vector control or overexpressing HSP104 and analysed by SDS-PAGE and silver staining. Western blot analysis of the same strains probed with α-Hsp104 or α-Pgk1.</p