Responses of the Mediterranean seagrass Cymodocea nodosa to combined temperature and salinity stress at the ionomic, transcriptomic, ultrastructural and photosynthetic levels

Acknowledgements We are particularly grateful to David E. Salt and John M.C. Danku (University of Aberdeen, now at the University of Nottingham) for providing facilities and guidance for the ionomics work within the framework of this study. This research was funded by the European Commission (European Social Fund – ESF; grant no. 375425) and Greek national funds through the Operational Program “Education and Lifelong Learning” of the National Strategic Reference Framework (NSRF) - Research Funding Program: THALES - Investing in knowledge society through the European Social Funds (Project Acronym: MANTOLES). We would also like to thank the TOTAL Foundation (Project “Diversity of brown algae in the Eastern Mediterranean”), the European Commission under its Horizon 2021 Research and Innovation Programme (grants ZEROBRINE, grant agreement No. 730390, and WATERMINING, grant agreement No. 869474) and the UK Natural Environment Research Council for their Supplort to FCK (program Oceans 2025 – WP 4.5 and grants NE/D521522/1 and NE/J023094/1). The MASTS pooling initiative (Marine Alliance for Science and Technology for Scotland, funded by the Scottish Funding Council and contributing institutions; grant reference HR09011) is gratefully acknowledged.Peer reviewedPostprin

Study of abiotic stress on the cell structure of the seagrasses

Seagrasses are aquatic plant organisms that grow in coastal and transitional waters. Among the angiosperms that occur in the Mediterranean, the species occupy a dominant position are Cymodocea nodosa, Ruppia cirrhosa and Posidonia oceanica. They form meadows of vital importance, for coastal and marine ecosystems. Unfortunately, over the past eighty years, these ecologically and economically important habitats have declined in several areas due to extreme fluctuations in key water parameters such as transmitted radiation, salinity levels, high temperatures and acidification conditions (Waycott et al., 2009). In this PhD thesis, the effect of different abiotic conditions was studied (acidification, temperature, salinity) in three dominant species of (Cymodocea nodosa, Posidonia oceanica and Ruppia cirrhosa), with main purpose to determine the scope, limits and the way and the effects of climate change at the cell structure.Shoots of the seagrasses were transferred from the control area to the two venting areas at different times. Epidermal cells of young leaves were examined using transmission electron microscopy (TEM) and tubulin immunofluorescence. After one week at pH 7.8, the cell structure of Posidonia oceanica was normal, while in Cymodocea nodosa, microtubule (MT) network and cell structure were affected. In addition, in C. nodosa, ultrastructural analysis revealed a gradual degradation of the nuclei, a disorganization of the chloroplasts, and an increase in the number of mitochondria and dictyosomes. The exposure of both plants for 3 weeks at pH 6.8 resulted in the aggregation and finally in the dilation of the endoplasmic reticulum (ER) membranes. Tubulin immunofluorescence revealed that after three weeks, the MT cytoskeleton of both plants was severely affected. All these alterations can be considered as indications of an apoptotic-like programmed cell death (AL-PCD), which may be executed in order to regulate stress response.High temperature affects the microtubule (MT) organization and the cell structure of young epidermal leaf cells of the seagrass The interphase MT network was affected by the increased temperature, the effect being time dependent and expressed in both the form and the orientation of the MT bundles. There was also a severe disturbance in dividing cells with thick and short MTs in the mitotic spindle and atypically organized phragmoplasts. TEM observation revealed cells with uncompleted cell plates consisting of swollen vesicles and branched cisternae, with no phragmoplast MTs. These cells bear a nucleolus with segregated fibrillar and granular zones, an increased number of swollen mitochondria, and numerous parallel arrays of endoplasmic reticulum cisternae in the cortical cytoplasm. The possible relationship of these changes with a response mechanism in order to face elevated temperature effects of climate change is analyzed.High salinity and high temperature, alone and in combination, affected ion equilibrium in the plant cells. Cell structure, especially the nucleus, chloroplasts, mitochondria and organization of the MT cytoskeleton, was also altered. Both temperature and salinity stress negatively affected photosynthetic activity as evidenced by ΔF/Fm’, following an antagonistic interaction type. All biological levels were strongly affected by temperature and salinity stress, however, with the latter having more severe effects.Τα Θαλάσσια Μακρόφυτα (μακροφύκη και θαλάσσια αγγειόσπερμα - ΘΑ) είναι υδρόβιοι φυτικοί οργανισμοί που αναπτύσσονται σε παράκτια και μεταβατικά ύδατα. Μεταξύ των αγγειοσπέρμων που απαντούν στη Μεσόγειο, κυρίαρχη θέση κατέχουν τα είδη Cymodocea nodosa, Ruppia cirrhosa, Halophila stipulacea και Posidonia oceanica. Τα είδη αυτά σχηματίζουν λιβάδια τα οποία είναι ζωτικής σημασίας, για τα παράκτια και θαλάσσια οικοσυστήματα. Εκτός από την χρησιμότητά τους ως καταφύγιο για πολλούς οργανισμούς, διαδραματίζουν και άλλους σημαντικούς ρόλους, όπως η σταθεροποίηση των ιζημάτων και η συμμετοχή τους στην ανακύκλωση βιογεωχημικών στοιχείων. Δυστυχώς, κατά τη διάρκεια των τελευταίων ογδόντα ετών, αυτοί οι σημαντικοί σε οικολογικό και οικονομικό επίπεδο οικότοποι έχουν μειωθεί σε διάφορες περιοχές, λόγω των ακραίων διακυμάνσεων βασικών παραμέτρων του νερού, όπως η διερχόμενη ακτινοβολία, τα επίπεδα αλατότητας, οι υψηλές θερμοκρασίες και οι συνθήκες οξίνισης (Waycott et al., 2009).Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών αβιοτικών καταπονήσεων (οξίνιση, θερμοκρασία, αλατότητα) σε τρία κυρίαρχα είδη ΘΑ της περιοχής της Μεσογείου (Cymodocea nodosa, Posidonia oceanica και Ruppia cirrhosa), με κύριο σκοπό να προσδιοριστεί το εύρος, τα όρια και ο τρόπος που θα επηρεαστούν από τις επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής σε κυτταρικό επίπεδο.Σε συνθήκες καταπόνησης οξίνισης μετά από 20 ημέρες σε pH 7.8 επηρεάζεται η δομή των επιδερμικών κυττάρων. Μετά από 7 και 20 ημέρες σε ακόμα πιο χαμηλό pH (6.8) τα κυτταρικά οργανίδια επηρεάζονται περισσότερο. Στα επιδερμικά κύτταρα παρατηρείται ένας μεγάλος κεντρικός πυρήνας και γύρω από αυτόν υπάρχουν διάσπαρτα οργανίδια που έχουν χάσει πλήρως την εσωτερική τους οργάνωση. Τέλος, παρατηρούνται εκτενή τμήματα ΕΔ με συσσώρευση ηλεκτρονιόπυκνου υλικού στις μεμβράνες του. Ο κυτταροσκελετός εμφανίζεται αποδιοργανωμένος με κοντές σπασμένες δέσμες ΜΣ με άτυπο προσανατολισμό. Σε συνθήκες καταπόνησης αλατότητας για 20 ημέρες σε 50 βαθμούς, στα φυτά C. nodosa και R. cirrhosa δεν παρατηρούνται μεγάλες αλλαγές της κυτταρικής δομής παρά μόνο αυξημένα σε αριθμό και μεγαλύτερα χυμοτόπια. Επίσης οι χλωροπλάστες είναι πιο πολλοί και πιο μεγάλοι. Σε αλατότητα πιο χαμηλή από 35 (20, 5) και στα δύο φυτά μετά από 20 ημέρες παρατηρούνται πολύ παχιά κυτταρικά τοιχώματα, μεγάλος αριθμός και αυξημένο μέγεθος χλωροπλαστών με καλά ανεπτυγμένα grana.Σε συνθήκες θερμοκρασιακής καταπόνησης μετά από 20 ημέρες στους 34, εως 38 °C στα φυτά C. nodosa και R. cirrhosa παρατηρείται αποδιοργάνωση του πυρηνίσκο. Τα μιτοχόνδρια είναι αυξημένα σε αριθμό με ποικίλο μέγεθος και σχήμα, ενώ σε έντονες καταπονήσεις χάνουν την εσωτερική τους οργάνωση. Οι χλωροπλάστες αυξάνονται σε αριθμό και δεν υπάρχει η τυπική οργάνωση θυλακοειδών στρώματος και grana. Σε έντονες καταπονήσεις παρατηρούνται παχιές δέσμες και απουσιάζουν μιτωτικά κύτταρα με αδυναμία σχηματισμού ΠΠΖΜ και φραγμοπλάστη.Η καταπόνηση οξίνισης και υψηλής θερμοκρασίας αλλάζει την κυτταρική δομή και πιθανώς ενεργοποιείται η διαδικασία προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (Programmed Cell Death- PCD). Αντίθετα, στην καταπόνηση αλατότητας στα ΘΑ φαίνεται ότι η ένταση και η χρονική διάρκεια της καταπόνησης δεν ήταν αρκετά μεγάλη για να οδηγήσουν σε αυξημένη συγκέντρωση μετάλλων στο εσωτερικό του κυττάρου και ως επακόλουθο μεγάλη αλλαγή της κυτταρικής δομής του. Φαίνεται ότι υπάρχει μια προσαρμογή του κυττάρου με την δημιουργία είτε μεγάλων παχιών κυτταρικών τοιχωμάτων σε χαμηλή αλατότητα είτε μεγάλων χυμοτοπίων σε υψηλή αλατότητα

«ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΊΔΡΑΣΗΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΩΝ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΩΝ ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΘΑΛΑΣΣΙΩΝ ΑΓΓΕΙΟΣΠΕΡΜΩΝ»

Τα Θαλάσσια Μακρόφυτα (μακροφύκη και θαλάσσια αγγειόσπερμα - ΘΑ) είναι υδρόβιοι φυτικοί οργανισμοί που αναπτύσσονται σε παράκτια και μεταβατικά ύδατα. Μεταξύ των αγγειοσπέρμων που απαντούν στη Μεσόγειο, κυρίαρχη θέση κατέχουν τα είδη Cymodocea nodosa, Ruppia cirrhosa, Halophila stipulacea και Posidonia oceanica. Τα είδη αυτά σχηματίζουν λιβάδια τα οποία είναι ζωτικής σημασίας, για τα παράκτια και θαλάσσια οικοσυστήματα. Εκτός από την χρησιμότητά τους ως καταφύγιο για πολλούς οργανισμούς, διαδραματίζουν και άλλους σημαντικούς ρόλους, όπως η σταθεροποίηση των ιζημάτων και η συμμετοχή τους στην ανακύκλωση βιογεωχημικών στοιχείων. Δυστυχώς, κατά τη διάρκεια των τελευταίων ογδόντα ετών, αυτοί οι σημαντικοί σε οικολογικό και οικονομικό επίπεδο οικότοποι έχουν μειωθεί σε διάφορες περιοχές, λόγω των ακραίων διακυμάνσεων βασικών παραμέτρων του νερού, όπως η διερχόμενη ακτινοβολία, τα επίπεδα αλατότητας, οι υψηλές θερμοκρασίες και οι συνθήκες οξίνισης (Waycott et al., 2009) Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών αβιοτικών καταπονήσεων (οξίνιση, θερμοκρασία, αλατότητα) σε τρία κυρίαρχα είδη ΘΑ της περιοχής της Μεσογείου (Cymodocea nodosa, Posidonia oceanica και Ruppia cirrhosa), με κύριο σκοπό να προσδιοριστεί το εύρος, τα όρια και ο τρόπος που θα επηρεαστούν από τις επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής σε κυτταρικό επίπεδο. Σε συνθήκες καταπόνησης οξίνισης μετά από 20 ημέρες σε pH 7.8 επηρεάζεται η δομή των επιδερμικών κυττάρων. Μετά από 7 και 20 ημέρες σε ακόμα πιο χαμηλό pH (6.8) τα κυτταρικά οργανίδια επηρεάζονται περισσότερο. Στα επιδερμικά κύτταρα παρατηρείται ένας μεγάλος κεντρικός πυρήνας και γύρω από αυτόν υπάρχουν διάσπαρτα οργανίδια που έχουν χάσει πλήρως την εσωτερική τους οργάνωση. Τέλος, παρατηρούνται εκτενή τμήματα ΕΔ με συσσώρευση ηλεκτρονιόπυκνου υλικού στις μεμβράνες του. Ο κυτταροσκελετός εμφανίζεται αποδιοργανωμένος με κοντές σπασμένες δέσμες ΜΣ με άτυπο προσανατολισμό. Σε συνθήκες καταπόνησης αλατότητας για 20 ημέρες σε 50 βαθμούς, στα φυτά C. nodosa και R. cirrhosa δεν παρατηρούνται μεγάλες αλλαγές της κυτταρικής δομής παρά μόνο αυξημένα σε αριθμό και μεγαλύτερα χυμοτόπια. Επίσης οι χλωροπλάστες είναι πιο πολλοί και πιο μεγάλοι. Σε αλατότητα πιο χαμηλή από 35 (20, 5) και στα δύο φυτά μετά από 20 ημέρες παρατηρούνται πολύ παχιά κυτταρικά τοιχώματα, μεγάλος αριθμός και αυξημένο μέγεθος χλωροπλαστών με καλά ανεπτυγμένα grana. Σε συνθήκες θερμοκρασιακής καταπόνησης μετά από 20 ημέρες στους 34, εως 38 °C στα φυτά C. nodosa και R. cirrhosa παρατηρείται αποδιοργάνωση του πυρηνίσκο. Τα μιτοχόνδρια είναι αυξημένα σε αριθμό με ποικίλο μέγεθος και σχήμα, ενώ σε έντονες καταπονήσεις χάνουν την εσωτερική τους οργάνωση. Οι χλωροπλάστες αυξάνονται σε αριθμό και δεν υπάρχει η τυπική οργάνωση θυλακοειδών στρώματος και grana. Σε έντονες καταπονήσεις παρατηρούνται παχιές δέσμες και απουσιάζουν μιτωτικά κύτταρα με αδυναμία σχηματισμού ΠΠΖΜ και φραγμοπλάστη. Η καταπόνηση οξίνισης και υψηλής θερμοκρασίας αλλάζει την κυτταρική δομή και πιθανώς ενεργοποιείται η διαδικασία προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (Programmed Cell Death- PCD). Αντίθετα, στην καταπόνηση αλατότητας στα ΘΑ φαίνεται ότι η ένταση και η χρονική διάρκεια της καταπόνησης δεν ήταν αρκετά μεγάλη για να οδηγήσουν σε αυξημένη συγκέντρωση μετάλλων στο εσωτερικό του κυττάρου και ως επακόλουθο μεγάλη αλλαγή της κυτταρικής δομής του. Φαίνεται ότι υπάρχει μια προσαρμογή του κυττάρου με την δημιουργία είτε μεγάλων παχιών κυτταρικών τοιχωμάτων σε χαμηλή αλατότητα είτε μεγάλων χυμοτοπίων σε υψηλή αλατότητα.Seagrasses are aquatic plant organisms that grow in coastal and transitional waters. Among the angiosperms that occur in the Mediterranean, the species occupy a dominant position are Cymodocea nodosa, Ruppia cirrhosa and Posidonia oceanica. They form meadows of vital importance, for coastal and marine ecosystems. Unfortunately, over the past eighty years, these ecologically and economically important habitats have declined in several areas due to extreme fluctuations in key water parameters such as transmitted radiation, salinity levels, high temperatures and acidification conditions (Waycott et al., 2009). In this PhD thesis, the effect of different abiotic conditions was studied (acidification, temperature, salinity) in three dominant species of (Cymodocea nodosa, Posidonia oceanica and Ruppia cirrhosa), with main purpose to determine the scope, limits and the way and the effects of climate change at the cell structure. Shoots of the seagrasses were transferred from the control area to the two venting areas at different times. Epidermal cells of young leaves were examined using transmission electron microscopy (TEM) and tubulin immunofluorescence. After one week at pH 7.8, the cell structure of Posidonia oceanica was normal, while in Cymodocea nodosa, microtubule (MT) network and cell structure were affected. In addition, in C. nodosa, ultrastructural analysis revealed a gradual degradation of the nuclei, a disorganization of the chloroplasts, and an increase in the number of mitochondria and dictyosomes. The exposure of both plants for 3 weeks at pH 6.8 resulted in the aggregation and finally in the dilation of the endoplasmic reticulum (ER) membranes. Tubulin immunofluorescence revealed that after three weeks, the MT cytoskeleton of both plants was severely affected. All these alterations can be considered as indications of an apoptotic-like programmed cell death (AL-PCD), which may be executed in order to regulate stress response. High temperature affects the microtubule (MT) organization and the cell structure of young epidermal leaf cells of the seagrass The interphase MT network was affected by the increased temperature, the effect being time dependent and expressed in both the form and the orientation of the MT bundles. There was also a severe disturbance in dividing cells with thick and short MTs in the mitotic spindle and atypically organized phragmoplasts. TEM observation revealed cells with uncompleted cell plates consisting of swollen vesicles and branched cisternae, with no phragmoplast MTs. These cells bear a nucleolus with segregated fibrillar and granular zones, an increased number of swollen mitochondria, and numerous parallel arrays of endoplasmic reticulum cisternae in the cortical cytoplasm. The possible relationship of these changes with a response mechanism in order to face elevated temperature effects of climate change is analyzed. High salinity and high temperature, alone and in combination, affected ion equilibrium in the plant cells. Cell structure, especially the nucleus, chloroplasts, mitochondria and organization of the MT cytoskeleton, was also altered. Both temperature and salinity stress negatively affected photosynthetic activity as evidenced by ΔF/Fm’, following an antagonistic interaction type. All biological levels were strongly affected by temperature and salinity stress, however, with the latter having more severe effects

In situ experiments on the effect of low pH on the ultrastructure of the seagrasses Cymodocea nodosa and Posidonia oceanica

The present study investigates the impacts of low pH on the cell structure of the seagrasses Posidonia oceanica (L.) Delile and Cymodocea nodosa (Ucria) Ascherson. The study was applied with in situ experiments at the Castello Aragonese of Ischia (Naples, Italy), where shallow submarine vents, lowering the pH, can be used as natural laboratories. Shoots of the seagrasses were transferred from the control area (pH 8.1) to the two venting areas (pH 7.8 and 6.8) for different times. Epidermal cells of young leaves were examined using transmission electron microscopy (TEM) and tubulin immunofluorescence. After one week at pH 7.8, the cell structure of Posidonia oceanica was normal, while in Cymodocea nodosa microtubule (MT) network and cell structure were affected. In addition, in C. nodosa, ultrastructural analysis revealed a gradual degradation of the nuclei, a disorganization of the chloroplasts, and an increase in the number of mitochondria and dictyosomes. The exposure of both plants for 3 weeks at pH 6.8 resulted in the aggregation and finally in the dilation of the endoplasmic reticulum (ER) membranes. Tubulin immunofluorescence revealed that after three weeks, the MT cytoskeleton of both plants was severely affected. All these alterations can be considered as indications of an apoptotic like programmed cell death (AL-PCD) which may be executed in order to regulate stress response