Identification of a novel human polyomavirus in organs of the gastrointestinal tract

Peer reviewedPublisher PD

Etablierung eines siRNA-basierten Systems zur Untersuchung pockenviraler host-range-Effekte

In den letzten Jahren wurden weltweit vermehrt humane Infektionen mit Orthopockenviren (OPV) beobachtet. Hierbei handelte es sich in allen Fällen um Zoonosen, bei denen tierpathogene OPV beim Menschen Erkrankungen hervorriefen. Die molekularen Mechanismen, die für einen solchen Spezieswechsel der OPV verantwortlich sind, sind bisher weitgehend unverstanden. Für die orthopockenviralen Gene C7L, K1L und CP77 wurde ein Einfluss auf den sogenannten host-range der OPV beschrieben. Ziel dieser Arbeit war es, unter Verwendung der Methode der RNA-Interferenz ein in vitro Modell zur Untersuchung von host-range-Effekten durch einen knockdown dieser Gene zu generieren. Die Zelllinien HEK293T, RK13 und CHO-K1 wurden hierfür mit short hairpin RNAexprimierenden Plasmiden transfiziert, wobei die short hairpin RNAs intrazellulär zu aktiven small interfering RNAs (siRNAs) prozessiert werden. Nach Infektion der transfizierten Zellen mit Kamelpockenvirus (CMLV) CP-19, Vacciniavirus (VACV) Western Reserve und Kuhpockenvirus (CPXV) Brighton Red erfolgte die Untersuchung des knockdowns der host-range-Gene auf RNA-Ebene mittels Reverser Transkriptase Real-Time-PCR. Der indirekte Immunfluoreszenzassay (IFA), Plaque-Titrationstest und Impedanzmessung wurden eingesetzt, um eine siRNA-vermittelte Inhibition der Virusreplikation nachzuweisen. In HEK293T-Zellen konnte durch Einsatz von siRNAs eine relative C7LGenexpression von 20 % ± 10 % erzielt werden. In RK13-Zellen wurde die K1LGenexpression auf 20 % reduziert. Die siRNA-vermittelte Inhibition der Replikation von CMLV CP-19 und VACV WR konnte mittels IFA, im Plaque-Titrationstest und in der Impedanzanalyse nachgewiesen werden. Die Genexpression von CP77 in CHO-K1- Zellen wurde durch Einsatz von siRNAs auf 13 % ± 2 % reduziert. Die Effekte der siRNA auf die Replikation des CPXV BR konnten nicht vollständig geklärt werden. Die etablierten siRNA-basierten Systeme wurden weiterhin auf ihre Validität in Kamelund Nagetierzellen untersucht. Die Transfektionsbedingungen wurden optimiert und eine permissive Infektion der drei Virusstämme in beiden Zelllinien nachgewiesen. Die etablierten siRNA-basierten Systeme bieten eine effiziente Alternative zur Erzeugung von Deletionsmutanten und können in weiterführenden Transkriptom- und Proteomanalysen einen Beitrag zur Aufklärung von molekularen Mechanismen des Wirtstropismus der Pockenviren liefern.During the last years, there has been an increasing number of zoonotic infections in humans caused by Orthopoxviruses (OPV). Until today, the molecular mechanisms that enable OPV to overcome species barriers are still not completely understood. The orthopoxviral genes C7L, K1L and CP77 are known to play an important role in the mediation of OPV host range. The aim of this project was to generate an in vitro model for the investigation of host range effects by introducing a knockdown of these host range genes using RNA interference. The eukaryotic cell lines HEK293T, RK13 and CHO-K1 were transfected with short hairpin RNA-expressing vectors, being processed to active siRNAs via intracellular mechanisms. The cells were infected with Camelpoxvirus (CMLV) CP-19, Vacciniavirus (VACV) Western Reserve and Cowpoxvirus (CPXV) Brighton Red. Reverse transcriptase real-time PCR was used to investigate the knockdown at RNA level. Indirect immunofluorescence assay (IFA), plaque assay and impedance measurement were applied for detection of siRNAmediated inhibition of poxviral replication. In HEK293T cells, a relative gene expression of C7L of 20 % ± 10 % was achieved. The relative gene expression of K1L in RK13 cells was reduced to 20 %. siRNAmediated inhibition of CMLV CP-19 and VACV WR replication was shown via IFA, plaque titration assay and impedance measurement. The relative gene expression of CP77 in CHO-K1 cells was reduced to 13 % ± 2 %. The effect of the used siRNA on CPXV BR replication could not be entirely elucidated. The established siRNA-based systems were additionally analysed on a camel and a rodent cell line. Transfection conditions were optimised and viral replication of the three poxvirus strains CMLV CP-19, VACV WR and CPXV BR was shown to be permissive in both cell lines. The established siRNA-based systems are an efficient alternative to the generation of deletion mutants and can be analysed in subsequent transcriptome and proteome analysis. This is useful for further investigation of the molecular mechanisms determining poxvirus host tropism

Partielle Charakterisierung der neuartigen humanen Polyomaviren HPyV9 und HPyV12

Im letzten Jahrzehnt wurden elf neue humane Polyomaviren (PyV) und zahlreiche tierische PyV identifiziert. Die Charakteristika dieser PyV wie Gewebetropismus, zelluläre Eintritts- und Infektionsmechanismen sind bislang ungeklärt. Humanes PyV 9 (HPyV9), im Serum eines Nierentransplantat-Empfängers entdeckt, und Humanes PyV 12 (HPyV12), in Proben von kolorektalen Lebermetastasen identifiziert, sind zwei neuartige humane PyV, deren partielle Charakterisierung Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist. Dies umfasst die Untersuchung ihrer Genoprävalenz in Gewebeproben von Patienten mit malignen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes (GIT), der VP1 (Hauptkapsidprotein)-basierten Seroprävalenz von HPyV9 und HPyV12 und der Seroreaktivität gegen HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in Seren von Blutspendern (n = 100), Patienten mit malignen (n = 54) und mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT (n = 32). Hinzu kommt die Etablierung eines Protokolls für die Identifikation potentieller Zelllinien als in vitro-Replikationssysteme für die beiden PyV, welche u. a. die Analyse von Spleiß-Mechanismen der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 erlauben. Die mittels quantitativer PCR in Gewebeproben ermittelte Genoprävalenz lag bei 0 % für HPyV9 und bei 2,8 % für HPyV12 und deutet nicht auf einen Gewebetropismus der beiden PyV in den vorliegenden Materialien hin. Zur Bestimmung der Seroprävalenz von HPyV9- und HPyV12-VP1 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA verwendet. Die Seroprävalenz von HPyV9-VP1 war in Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT signifikant höher als in jenen von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT und in jenen von Blutspendern (59 % vs. 37 % (p = 0,02) und vs. 32 % (p = 0,04). Die HPyV12-VP1-Seroprävalenz lag bei 8 % (Blutspender), 20 % (Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT) und 25 % (Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT) (Unterschiede nicht signifikant, p > 0,05). Zur Bestimmung der Seroreaktivitäten gegen die ersten 78 N-terminalen Aminosäuren wurde ein TAg-basierter ELISA angewendet. Seroreaktivitäten von 17 % bis 39 % für HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in allen drei Serengruppen deuteten auf eine Präsenz von IgG-Antikörpern gegen diese Antigene in der allgemeinen Bevölkerung hin. In Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT war die HPyV9-TAg(78aa)-Seroreaktivität signifikant höher als in jenen von Blutspendern (39 % vs. 34 %, p = 0,04). Das Protokoll zur Untersuchung von Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro-Replikationssystem für beide Viren identifizierte die Vero-Zelllinie als vergleichsweise gut geeignet. Sie zeigte die stärkste Zunahme an VP1-mRNA-Kopien beider PyV und erlaubte die Beobachtung zytopathischer Effekte, die Anfärbung viraler Proteine im Immunfluoreszenzassay und die Analyse von Spleiß-Vorgängen der frühen Genregionen. Neben für das kleine und große T-Antigen kodierenden, gespleißten mRNAs wurden die bisher unbekannten, alternativen Spleiß-Produkte HPyV9-145T und HPyV12-84T detektiert. Für HPyV12 wurden weitere Spleiß-Varianten identifiziert, die nicht-kanonische Spleiß-Sequenzen aufwiesen. Die präsentierten Ergebnisse tragen erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der neuartigen HPyV9 und HPyV12 bei. Die Schlussfolgerungen zur Geno- und Seroprävalenz erfordern weitere Analysen mit alternativen bzw. größeren Probengruppen. Das Protokoll zur Testung von Zelllinien sollte weiter optimiert und ggf. auf primäre Zelllinien ausgeweitet werden. Von gesondertem Interesse wird die Untersuchung des transformierenden Potentials der neuartigen Spleiß-Varianten der T-Antigene sein, da für diese ein Zusammenhang mit der onkogenen Transformation von Wirtszellen sowie ein Einfluss auf die Pathogenese vermutet werden kann

Partial characterization of the novel human polyomaviruses HPyV9 and HPyV12

Im letzten Jahrzehnt wurden elf neue humane Polyomaviren (PyV) und zahlreiche tierische PyV identifiziert. Die Charakteristika dieser PyV wie Gewebetropismus, zelluläre Eintritts- und Infektionsmechanismen sind bislang ungeklärt. Humanes PyV 9 (HPyV9), im Serum eines Nierentransplantat-Empfängers entdeckt, und Humanes PyV 12 (HPyV12), in Proben von kolorektalen Lebermetastasen identifiziert, sind zwei neuartige humane PyV, deren partielle Charakterisierung Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist. Dies umfasst die Untersuchung ihrer Genoprävalenz in Gewebeproben von Patienten mit malignen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes (GIT), der VP1 (Hauptkapsidprotein)-basierten Seroprävalenz von HPyV9 und HPyV12 und der Seroreaktivität gegen HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in Seren von Blutspendern (n=100), Patienten mit malignen (n=54) und mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT (n=32). Hinzu kommt die Etablierung eines Protokolls für die Identifikation potentieller Zelllinien als in vitro-Replikationssysteme für die beiden PyV, welche u. a. die Analyse von Spleiß-Mechanismen der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 erlauben. Die mittels quantitativer PCR in Gewebeproben ermittelte Genoprävalenz lag bei 0 % für HPyV9 und bei 2,8 % für HPyV12 und deutet nicht auf einen Gewebetropismus der beiden PyV in den vorliegenden Materialien hin. Zur Bestimmung der Seroprävalenz von HPyV9- und HPyV12-VP1 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA verwendet. Die Seroprävalenz von HPyV9-VP1 war in Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT signifikant höher als in jenen von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT und in jenen von Blutspendern (59 % vs. 37 % (p=0,02) und vs. 32 % (p=0,04). Die HPyV12-VP1-Seroprävalenz lag bei 8 % (Blutspender), 20 % (Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT) und 25 % (Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT) (Unterschiede nicht signifikant, p>0,05). Zur Bestimmung der Seroreaktivitäten gegen die ersten 78 N-terminalen Aminosäuren wurde ein TAg-basierter ELISA angewendet. Seroreaktivitäten von 17 % bis 39 % für HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in allen drei Serengruppen deuteten auf eine Präsenz von IgG-Antikörpern gegen diese Antigene in der allgemeinen Bevölkerung hin. In Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT war die HPyV9-TAg(78aa)-Seroreaktivität signifikant höher als in jenen von Blutspendern (39 % vs. 34 %, p=0,04). Das Protokoll zur Untersuchung von Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro-Replikationssystem für beide Viren identifizierte die Vero-Zelllinie als vergleichsweise gut geeignet. Sie zeigte die stärkste Zunahme an VP1-mRNA-Kopien beider PyV und erlaubte die Beobachtung zytopathischer Effekte, die Anfärbung viraler Proteine im Immunfluoreszenzassay und die Analyse von Spleiß-Vorgängen der frühen Genregionen. Neben für das kleine und große T-Antigen kodierenden, gespleißten mRNAs wurden die bisher unbekannten, alternativen Spleiß-Produkte HPyV9-145T und HPyV12-84T detektiert. Für HPyV12 wurden weitere Spleiß-Varianten identifiziert, die nicht-kanonische Spleiß-Sequenzen aufwiesen. Die präsentierten Ergebnisse tragen erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der neuartigen HPyV9 und HPyV12 bei. Die Schlussfolgerungen zur Geno- und Seroprävalenz erfordern weitere Analysen mit alternativen bzw. größeren Probengruppen. Das Protokoll zur Testung von Zelllinien sollte weiter optimiert und ggf. auf primäre Zelllinien ausgeweitet werden. Von gesondertem Interesse wird die Untersuchung des transformierenden Potentials der neuartigen Spleiß-Varianten der T-Antigene sein, da für diese ein Zusammenhang mit der onkogenen Transformation von Wirtszellen sowie ein Einfluss auf die Pathogenese vermutet werden kann.Eleven novel human polyomaviruses (PyVs) and various animal PyVs have been identified during the last ten years. Basic characteristics like tissue tropism, cellular entry and infection mechanisms of these viruses will be the subject of future studies. The present thesis deals with the partial characterization of two novel human PyVs, the human polyomaviruses 9 (HPyV9) and 12 (HPyV12). Both were recently discovered, HPyV9 in the serum of a renal transplant recipient and HPyV12 in metastatic liver tissue. Here, genoprevalence and seroprevalence of HPyV9 and HPyV12 were analysed in different subject groups, cell lines were searched that support their replication, and HPyV9 and HPyV12 tumor antigens (TAg) were identified on the mRNA level. In tissue samples of patients suffering from malignant diseases of the gastro-intestinal tract (GIT), quantitative PCR yielded genoprevalences of 0 % for HPyV9 and 2.8 % for HPyV12. In ELISA based on viral major capsid protein (VP1), seroprevalence of HPyV9 was significantly higher in sera from patients with non-malignant diseases of the GIT (59 %) than that in sera of patiens with malignant diseases of the GIT (37 %, p=0.02), and in sera of blood donors (32 %, p=0.04). VP1 seroprevalences of HPyV12 (8 % in blood donors, 20 % in patients with malignant diseases of the GIT, 25 % in patients with non-malignant diseases of the GIT) were generally lower and without significant differences (p>0.05). Similarly, ELISA based on the common N-terminus (78 amino acids) of T antigens of either PyV revealed sero-reactivities of 17 % - 39 %. These data did not indicate any clear association of HPyV9 and HPyV12 with diseases of the GIT. Among the 12 cell lines tested to support HPyV9 and HPyV12 replication by transfection of synthetic genomes, the Vero cell line allowed the strongest increase in VP1 mRNA copies. Occasionally, cytopathic effects were observed, and viral proteins detected in immunofluorescence assay. Analysis of the early gene region of both viruses on the mRNA level resulted in identification of spliced LTAg- and small TAg-encoding mRNAs. In addition, so far unknown alternative TAgs (HPyV9-145T and HPyV12-84T) were identified. The results presented here contribute to the partial characterization of HPyV9 and HPyV12. Future studies concerning geno- and seroprevalence of the two PyV with alternative and larger sample panels are needed as the present results gave only first insights. The limitations of the protocol to test cell lines as potential in vitro replication systems might be overcome by further optimization and inclusion of primary cell lines. Characterization of the transforming potential of the identified LTAg splice variants will be of specific interest as they can be assumed to play a role in the oncogenic transformation of host cells and in pathogenesis

Detection of polyomaviruses in gastrointestinal and lymphoid organs with generic PCR.

a<p>Detected with generic PCR.</p

Genome organization of HPyV12.

<p>Putative coding regions for VP1 to VP3, STAg antigen, and LTAg antigen are marked by arrows.</p

Reactivity of human sera to VP1 of HPyV12.

<p>The percentage of seroreactivity of pediatric sera (n = 74; 2–11 years) and sera of healthy adolescents and adults (n = 299; age: 16–72 years) in ELISA is shown. The results were stratified by age.</p

Phylogenetic analysis of HPyV12.

<p>A Bayesian chronogram was deduced from the analysis of a 488 amino acid alignment of LTAg sequences. Polyomaviruses identified from human hosts are in red, from apes in blue. The human polyomaviruses MXPyV and the US strain of MWPyV have the same phylogenetic position as HPyV10 and are not shown. The sequence of the very recently discovered human STLPyV which is most closely related to HPyV10, MWPyV and MXPyV, became only available at the end of the revision process of this manuscript; it was therefore not included in the datasets put together for the present study. Statistical support for branches is given as posterior probability/bootstrap. For three branches defining potentially meaningful bipartitions (with respect to the question of the phylogenetic placement of HPyV12), statistical support observed for the corresponding bipartitions in the VP2 and VP1 analyses is also shown (grey panels). Hyphen indicates that bipartition was not observed in the ML or Bayesian tree. The scale axis is in amino acid substitution per site. This chronogram was rooted using a relaxed clock. A maximum likelihood analysis of the same dataset concluded to a similar topology and is thus not shown here.</p

Detection of HPyV12 with PCR.

a<p>Samples collected for BKPyV infection diagnosis.</p>b<p>From patients under natalizumab (Tysabri) therapy.</p>c<p>Samples collected for herpesvirus infection diagnosis.</p>d<p>Samples collected for JCPyV infection diagnosis.</p>e<p>Combined results of specific nested PCR and real-time PCR; samples were considered as positive if the result could be independently reproduced on different days.</p