X-ray structure of the quinoprotein ethanol dehydrogenase from \u3ci\u3ePseudomonas aeruginosa\u3c/i\u3e: basis of substrate specificity

The homodimeric enzyme form of quinoprotein ethanol dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa ATCC 17933 crystallizes readily with the space group R3. The X-ray structure was solved at 2.6 Å resolution by molecular replacement. Aside from differences in some loops, the folding of the enzyme is very similar to the large subunit of the quinoprotein methanol dehydrogenases from Methylobacterium extorquens or Methylophilus W3A1. Eight W-shaped β-sheet motifs are arranged circularly in a propeller-like fashion forming a disk-shaped superbarrel. No electron density for a small subunit like that in methanol dehydrogenase could be found. The prosthetic group is located in the centre of the superbarrel and is coordinated to a calcium ion. Most amino acid residues found in close contact with the prosthetic group pyrroloquinoline quinone and the Ca2+ are conserved between the quinoprotein ethanol dehydrogenase structure and that of the methanol dehydrogenases. The main differences in the active-site region are a bulky tryptophan residue in the active-site cavity of methanol dehydrogenase, which is replaced by a phenylalanine and a leucine side-chain in the ethanol dehydrogenase structure and a leucine residue right above the pyrrolquinoline quinone group in methanol dehydrogenase which is replaced by a tryptophan side-chain. Both amino acid exchanges appear to have an important influence, causing different substrate specificities of these otherwise very similar enzymes. In addition to the Ca2+ in the active-site cavity found also in methanol dehydrogenase, ethanol dehydrogenase contains a second Ca2+-binding site at the N terminus, which contributes to the stability of the native enzyme

Building ProteomeTools based on a complete synthetic human proteome.

We describe ProteomeTools, a project building molecular and digital tools from the human proteome to facilitate biomedical research. Here we report the generation and multimodal liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of \u3e330,000 synthetic tryptic peptides representing essentially all canonical human gene products, and we exemplify the utility of these data in several applications. The resource (available at http://www.proteometools.org) will be extended to \u3e1 million peptides, and all data will be shared with the community via ProteomicsDB and ProteomeXchange

Molecular modeling of antigenic peptides and their complexes with polyspecific antibodies

0\. TITELBLATT UND INHALTSVERZEICHNIS 1\. EINLEITUNG 1\. 1 BIOLOGISCHER HINTERGRUND 1\. 2 STRUKTURELLER HINTERGRUND 1\. 3 METHODISCHER HINTERGRUND 2\. MATERIAL UND METHODEN 2\. 1 STOCHASTISCHE GLOBALE OPTIMIERUNG UND MODELLIERUNG IM INTERNEN KOORDINATENRAUM 2\. 2 DESIGN CYCLISCHER PEPTIDE 2\. 3 COMPUTERRESSOURCEN 2\. 4 BINDUNGSSTUDIEN 3\. ERGEBNISSE 1.Teil 3\. 1 UMWANDLUNG ANTIGENER CB4-1 PEPTIDEPITOPE DURCH SCHRITTWEISEN AUSTAUSCH 3\. 2 KONFORMATIONSRAUM 3\. 3 KONFORMATIONSANALYSE DER PEPTIDE AUS DEN TRANSFORMATIONSWEGEN H-PEPU1-PEP UND H-PEPU2-PEP 3\. ERGEBNISSE 2.Teil 3\. 4 KONFORMATIONEN EINIGER ANTIGENER PEPTIDE IN CB4-1 KOMPLEXSTRUKTUREN 3\. 5 DOCKING-SIMULATIONEN LINEARER PEPTIDE MIT STOCHASTISCHER GLOBALER OPTIMIERUNG 3\. 6 DOCKING-SIMULATIONEN KONFORMATIONELL EINGESCHRÄNKTER PEPTIDE 3\. 7 SIMULATIONEN AN CYCLISCHEN UND LINEAREN TE33-BINDENDEN PEPTIDEN 4\. DISKUSSION 4\. 1 CB4-1 BINDENDE TRANSFORMATIONSPEPTIDE: SCHLÜSSELAMINOSÄUREN, VORZUGSKONFORMATION UND ENTROPIE 4\. 2 SUBSTITUTIONSANALYSEN, SEQUENZLANDSCHAFTEN UND BINDUNGSKONTINUUM 4\. 3 MODELLIERUNG VON ANTIKÖRPER-KOMPLEXEN MIT LINEAREN PEPTIDEN: KONFORMATIONSÄNDERUNGEN UND MULTIPLE BINDUNGSMODI 4\. 4 MODELLIERUNG VON ANTIKÖRPERKOMPLEXEN MIT KONFORMATIONELL EINGESCHRÄNKTEN PEPTIDEN 4\. 5 POLYSPEZIFITÄT UND KREUZREAKTIVITÄT 4\. 6 GRENZEN DER MOLEKULARMODELLIERUNG FÜR DIE KOMPLEX-STRUKTURVORHERSAGE 4\. 7 EINSCHRÄNKUNG DES KONFORMATIONSRAUMES DURCH CYCLISIERUNG 4\. 8 WIRKSTOFFENTWICKLUNG: RATIONELLES DESIGN VS. EMPIRISCHE ENTDECKUNG 4\. 9 SCHLUSSFOLGERUNGEN 5\. LITERATURPolyspezifität von Antikörpern, also die hochspezifische differentielle Erkennung verschiedener Epitope, wird als auslösender Faktor bei der Entstehung von Autoimmunkrankheiten wie Rheuma und Asthma diskutiert. Über die strukturellen Voraussetzungen dieses biologischen Phänomens ist bislang wenig bekannt; einzig für den Antikörper CB4-1 gibt es hochaufgelöste Röntgenkristallstrukturen von Komplexen mit nicht verwandten Peptidepitopen. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, in wieweit Strukturvorhersagen von Antikörper-Peptid-Komplexen mittels Molekularmodellierung geeignet sind, polyspezifisches Bindeverhalten zu charakterisieren. Als Modellsysteme für die Komplex-Strukturvorhersage durch globale stochastische Optimierung wurden drei monoklonale Antikörper gewählt: der anti-p24 (HIV-1) Antikörper CB4-1, der eine Reihe sequentiell ähnlicher sowie unähnlicher Peptide bindet; der anti-TGFa Antikörper tAb2, der neben dem linearen Wildtyp-Epitop verwandte cyclische Peptide erkennt; und der anti- Choleratoxinpeptid 3 Antikörper TE33, dessen Polyspezifität erst kürzlich mit Bindern einer Phagenbibliothek bewiesen wurde. Er bindet sowohl nicht verwandte lineare als auch cyclische Epitoppeptide. In einem ersten Schritt wurden die Konformationslandschaften der linearen, von CB4-1 erkannten Epitope durch Modellierung der ungebundenen 11-meren Peptide analysiert, wobei ein Zusammenhang zwischen diesen und den Konformationen der gebundenen Peptide in bekannten Komplexstrukturen gefunden wurde, der einen Einfluß auf die Affinität vermuten läßt. Auf diese Ergebnisse aufbauend wurden dann Antikörperkomplexe mit linearen Peptiden modelliert und mit bekannten Röntgenkristallstrukturen verglichen. Dabei zeigte sich, daß die globalen Konformationssuche-Simulationen in Gegenwart des Antikörpers Ergebnisse lieferten, die nur in Ausnahmefällen mit der gesuchten Struktur übereinstimmten. Darüber hinaus war die Konvergenz mehrerer unabhängiger, von verschiedenen Zufallskonformationen des gleichen Peptids ausgehender Simulationen in struktureller Hinsicht generell sehr schlecht. Nur für ein lineares Peptid, dessen Komplexstruktur bislang nicht bekannt ist, konvergierten wiederholte Monte-Carlo-Rechnungen in einer ähnlichen Konformationsfamilie. Die Simulationskonvergenz wird mutmaßlich durch die sehr große Anzahl von Freiheitsgraden linearer Peptide erschwert. Durch Cyclisierung kann aber der Konformationsraum von Peptiden erheblich verkleinert werden. Ist daher die Vorhersage von Komplexstrukturen konformationell eingeschränkter Peptide mit größerer Verifizierbarkeit zu erreichen? Diese Frage wurde an der publizierten dreidimensionalen Struktur des Antikörpers tAb2 im Komplex mit einem 7-meren, lactamcyclisierten Peptid überprüft. Wiederum ausgehend von zufällig erzeugten Konformationen, lieferten die stochastischen Simulationen dieses Peptids und homo- bzw. heterodetisch verknüpfter Homologa mit sehr guter Konvergenz Peptidstrukturen, die der bekannten in hervorragender Näherung entsprachen. In Erweiterung dieses Resultates sollten cyclische Peptide mit einer größeren Anzahl von Residuen innerhalb des Ringes getestet werden. Da es keine Kristallstrukturen von Antikörperkomplexen mit größeren, aus natürlichen Aminosäuren bestehenden Peptidcyclen gibt, wurde am Computer eine Reihe von cyclischen Analoga eines 11-meren linearen Templatpeptid konstruiert, dessen quasi-cyclische Konformation in der Bindungstasche des Antikörpers CB4-1 hochaufgelöst beschrieben ist. Bei der Vorhersage der Komplexstrukturen dieser sechs Disulfid- und Lactamcyclen konnte mit befriedigender Wiederholbarkeit die antizipierte Gesamtkonformation der linearen Vorlage ermittelt werden. Zusätzlich wurde mit biochemischen Bindungsstudien nachgewiesen, daß die konstruierten Analoga mit vergleichbarer Affinität und unter Beteiligung identischer funktioneller Gruppen an CB4-1 binden. Die gegenüber linearen Peptiden erhöhte Wahrscheinlichkeit, auch bei größeren Peptidcyclen die gebundene Konformation korrekt zu identifizieren, wurde schließlich genutzt, um die Komplexstruktur eines cyclischen, aus einer Phagenbibliothek ermittelten Peptids mit 11 Aminosäuren vorzuschlagen, das an den Antikörper TE33 bindet und keine Sequenzverwandtschaft mit dessen Wildtyp-Epitop aufweist. Die in unabhängigen Simulationen ohne Vorbeeinflussung wiederholt aufgefundene Struktur des Peptids im Komplex zeigt eine hervorragende Übereinstimmung mit dem Substituierbarkeitsmuster des Peptids. Im Vergleich mit der bekannten Komplexstruktur des linearen Wildtyp-Peptids ist bei sehr unterschiedlichen individuellen Kontakten eine überraschend ähnliche Gesamtkonformation des cyclischen Binders erkennbar. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß eine relativ verläßliche Strukturvorhersage von Antikörper-Komplexen durch globale stochastische Optimierung nur mit konformationell eingeschränkten Peptiden möglich ist unter der Maßgabe, daß sich keine gravierenden Konformationsänderungen beim Bindungspartner ergeben. Aus den gewonnenen Daten wird deutlich, daß polyspezifisches Bindeverhalten von Antikörpern letzlich nur auf atomarer Ebene begriffen werden kann. Eine Abhängigkeit von der Sequenz des Binders ist nur insofern erkennbar, als diese ein räumlich-sterisches Arrangement von Atomgruppen ermöglicht, das unter Berücksichtigung dynamischen Verhaltens zur Bindung führen kann. Unterschiedliche Peptidsequenzen können ähnliche Kontaktflächen hervorbringen und somit ähnliche Paratopresiduen erkennen; gleiche Gesamtkonformationenen gebundener Peptide müssen andererseits auch bei Sequenzähnlichkeit nicht zu ähnlichen Wechselwirkungen führen.Antibody polyspecificity, i. e. the highly specific differential recognition of various epitopes, has been implicated in the onset of autoimmune diseases such as asthma and rheumatism. Little is established about the structural prerequisites that drive this biological phenomenon; only for the monoclonal antibody CB4-1 high resolution X-ray structures of complexes with non-related peptide epitopes are known. The aim of this work is to investigate the applicability of antibody-peptide complex structure prediction by means of molecular modeling for the characterization of polyspecific binding behaviour. Three monoclonal antibodies were chosen as model systems for complex structure prediction by global stochastic optimization: the anti-p24 (HIV-1) antibody CB4-1 that binds to a number of sequentially related as well as unrelated peptides; the anti-TGFa antibody tAb2 which besides its linear wild type epitope also recognises similar cyclic peptides; and the anti-cholera toxin peptide 3 antibody TE33 whose polyspecificity was only recently demonstrated with ligands derived from a phage display library. The latter one binds not only to non-related linear but also to cyclic peptid epitopes. In a first step, the conformational landscapes of the linear epitopes recognised by CB4-1 were analysed by modeling the unbound 11-meric peptides. Here, a correlation to the conformations of the antibody-bound species in known complex structures can be identified which leads to assumptions about its influence on the binding affinity. Extending these findings, antibody complexes with linear peptides were modelled and compared with published X-ray crystal structures. The results show that global conformational search simulations in the presence of the antibody yield solutions that only in exceptional cases superimpose tolerably with the target structure. Moreover, convergence of several independent simulations of the same peptide, each starting from a different random conformation, was generally very poor in structural terms. Only for one linear peptide, whose complex structure is yet unknown, repeated Monte Carlo calculations converged in a similar conformational cluster. Simulation convergence is supposedly hampered by the vast number of degrees of freedom associated with linear peptides. The conformational space of peptides can be substantially reduced by means of cyclization. Therefore, can complex structure prediction of conformationally constrained peptides be achieved with greater verifiability? The published three-dimensional structure of the antibody tAb2 in complex with a 7-meric lactam-circularized peptid was used to address this question. Again starting from randomly generated conformations, stochastic simulations of this peptide as well as homodetic and heterodetic cyclic homologues yielded structures that were in excellent agreement with the expected one while exhibiting very good convergence. To validate this result, cyclic peptides with a larger number of residues within the ring structure had to be tested. Since no X-ray structures of antibody complexes with bigger peptide cycles containing all-natural residues are known, a number of cyclic analogues of an 11-meric linear peptide were constructed on-screen. The template peptide has been described in high resolution as exhibiting a quasi- cyclic conformation in the binding pocket of the antibody CB4-1. Complex structure predictions of the six disulfide and lactam-bridged analogues were able to identify the anticipated overall conformation with satisfying reproducibility. In addition, biochemical binding studies provided evidence that the constructed analoga bind to CB4-1 with comparable affinity while using identical functional groups. The bound conformation of a cyclic peptide can be predicted with higher probability compared to linear entities even when modeling bigger ring sizes. This potential was used to suggest the complex structure of a cyclic 11-meric peptide binding to the antibody TE33 that was identified from a phage display library and shares no sequence similarity with the wild type epitope. The peptide complex structure found repeatedly in unbiased independent simulations displays an excellent consistency with the amino acid substitution pattern. Compared to the published complex structure of the linear wild type peptide, a surprisingly similar overall conformation of the cyclic binder is discernible in spite of very different individual contacts. In conclusion it can be stated that a reliable structure prediction of antibody complexes by global stochastic optimization is feasible only for conformationally constrained peptides under the condition that no substantial antibody conformation change occurs upon binding. The data provided emphasize that polyspecific binding behaviour of antibodies is comprehensible only on the atomic level. The sequence of the binder merely provides a spatially and sterically restrictive framework of atom groups that can lead to a binding event if the dynamic behaviour is considered. Different peptide sequences can produce similar contact areas thus recognizing similar paratop regions; identical overall conformations of bound peptides do not indicate identical interactions even when the binders are closely related in sequence

Evolutionary transition pathways for changing peptide ligand specificity and structure

We identified evolutionary pathways for the inter- conversion of three sequentially and structurally unrelated peptides, GATPEDLNQKL, GLYEWGGARI and FDKEWNLIEQN, binding to the same site of the hypervariable region of the anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody CB4-1. Conversion of these peptides into each other could be achieved in nine or 10 single amino acid substitution steps without loss of antibody binding. Such pathways were identified by analyzing all 7 620 480 pathways connecting 2560 different peptides, and testing them for CB4-1 binding. The binding modes of intermediate peptides of selected optimal pathways were characterized using complete sets of substitution analogs, revealing that a number of sequential substitutions accumulated without changing the pattern of key interacting residues. At a distinct step, however, one single amino acid exchange induces a sudden change in the binding mode, indicating a flip in specificity and conformation. Our data represent a model of how different specificities, structures and functions might evolve in protein–protein recognition

PKC-theta is a novel SC35 splicing factor regulator in response to T cell activation

Alternative splicing of nuclear pre-mRNA is essential for generating protein diversity and regulating gene expression. Whilst many immunologically relevant genes undergo alternative splicing, the role of regulated splicing in T cell immune responses is largely unexplored, and the signaling pathways and splicing factors that regulate alternative splicing in T cells are poorly defined. Here we show using a combination of Jurkat T cells, human primary T cells, and ex vivo naïve and effector virus-specific T cells isolated after influenza A virus infection that SC35 phosphorylation is induced in response to stimulatory signals. We show that SC35 co-localizes with RNA polymerase II in activated T cells and spatially overlaps with H3K27ac and H3K4me3, which mark transcriptionally active genes. Interestingly, SC35 remains coupled to the active histone marks in the absence of continuing stimulatory signals. We show for the first time that nuclear PKC-θ co-exists with SC35 in the context of the chromatin template and is a key regulator of SC35 in T cells, directly phosphorylating SC35 peptide residues at RRM and RS domains. Collectively, our findings suggest that nuclear PKC-θ is a novel regulator of the key splicing factor SC35 in T cells

Antibody Responses After Analytic Treatment Interruption in Human Immunodeficiency Virus-1-Infected Individuals on Early Initiated Antiretroviral Therapy

The examination of antibody responses in human immunodeficiency virus (HIV)-1-infected individuals in the setting of antiretroviral treatment (ART) interruption can provide insight into the evolution of antibody responses during viral rebound. In this study, we assessed antibody responses in 20 subjects in AIDS Clinical Trials Group A5187, wherein subjects were treated with antiretroviral therapy during acute/early HIV-1 infection, underwent analytic treatment interruption, and subsequently demonstrated viral rebound. Our data suggest that early initiation of ART arrests the maturation of HIV-1-specific antibody responses, preventing epitope diversification of antibody binding and the development of functional neutralizing capacity. Antibody responses do not appear permanently blunted, however, because viral rebound triggered the resumption of antibody maturation in our study. We also found that antibody responses measured by these assays did not predict imminent viral rebound. These data have important implications for the HIV-1 vaccine and eradication fields

Biophysical characterization of Ani s 5 and effect of divalent cations.

<p><b>A</b>, Far-UV CD spectra of Ani s 5 in the absence (black) or in the presence of different cation concentrations: red, MgCl₂ 2 mM; green, MgCl₂ 20 mM; blue, MgCl₂ 100 mM; cyan, CaCl₂ 100 mM at pH 7. <b>B</b>, Fluorescence emission spectra after excitation at 350 nm of Ani s 5 (black), ANS (red), Ani s 5 with CaCl₂ (dark blue), Ani s 5 with MgCl₂ (yellow), ANS with Ani s 5 (green), ANS with CaCl₂ (cyan), ANS with MgCl₂ (olive green), Ani s 5 with ANS and CaCl₂ (magenta), and Ani s 5 with ANS and MgCl₂ (violet). <b>C</b>, SDS-PAGE of Ani s 5, Ani s 5 with EDTA, 2 mM CaCl₂ or 2 mM MgCl₂ 2. M denotes the molecular weight markers used and the asterisks indicate the 15 kDa standard.</p

Comparison between IgE and IgG₄ binding peptides detected by microarray immunoassay for each serum tested. Discrepancies between IgE and IgG4 binding peptides are in bold.

<p>Comparison between IgE and IgG₄ binding peptides detected by microarray immunoassay for each serum tested. Discrepancies between IgE and IgG4 binding peptides are in bold.</p

IgE binding epitopes detected. The minimum unit necessary for IgE recognition is shown in bold and the residues forming alpha helix are underlined.

<p>IgE binding epitopes detected. The minimum unit necessary for IgE recognition is shown in bold and the residues forming alpha helix are underlined.</p