Topkapı Sarayında Milli Portre Galerisi

Taha Toros Arşivi, Dosya No: 120-Saraylarİstanbul Kalkınma Ajansı (TR10/14/YEN/0033) İstanbul Development Agency (TR10/14/YEN/0033

新奇小胞体由来オルガネラ“ERボディ”の機能解析

　小胞体由来の新奇オルガネラであるERボディは、シロイヌナズナをはじめとするアブラナ科植物に存在する。ERボディは、アブラナ科植物の幼植物体全身の表皮に恒常的に存在するが、成熟葉には存在しない。アブラナ科植物の幼植物体全身の表皮に恒常的に存在するERボディを恒常型ERボディと名付けた。恒常型ERボディを欠く突然変異体nail変異株の解析から、恒常型ERボディに含まれる主な構成成分はPYK10と呼ばれるβグルコシダーゼであることがわかっている。一方で、恒常型ERボディが存在しない成熟葉に傷害を与えると、傷口の周りにERボディが誘導される。この傷害により誘導されるERボディを誘導型ERボディと名付けた。　恒常型ERボディは、生体防御に関与する例が多く知られているβグルコシダーゼであるPYK10タンパク質を内部に蓄積することに加え、誘導型ERボディは傷害、食害、ジャスモン酸メチル処理によって誘導されることから、ERボディの植物体内における機能は生体防御に関与すると考えられる。本研究では、傷害誘導と菌感染の二つを用いて、総合的なERボディの機能を明らかにすることを目的とした。　第1章では傷害誘導を用いた誘導型ERボディの解析を行った。まず、ERボディの数に着目し、誘導型ERボディが多く誘導される条件を検討した。その結果、小胞体をGFPで可視化した野生株(GFPh植物体)の発芽9日目の子葉組織を用いると、傷害後66時間でERボディの数が明確に増加することを見いだした。GFPh植物体の子葉の片方にのみ傷害を与えたところ、傷害を与えた子葉(locally-wounded cotyledon)のERボディの数が4倍以上に増加するとともに、傷害を与えていない子葉(systemically-wounded cotyledon)のERボディの数も5倍以上に増加した。GFPh植物体の子葉に傷害を与えた66時間後に定量PCRを行った結果、恒常型ERボディの主な内容物であるPYK10の発現量は変わらず、そのホモログであるBGLU18の発現が誘導されることが判明した。これらの結果より、恒常型と誘導型ERボディの内容物は異なることが明らかとなり、それぞれのERボディが異なった機能を果たしていることが示唆された。　第2章ではPseudomonas syringae pv. tomato(Pst) DC3000(avrRpm1)接種によって誘導されるシロイヌナズナの過敏感反応系および罹病性病原菌PstDC3000(vector)を用いて、植物の防御機構とERボディ内容物PYK10タンパク質の関わりを検討した。本研究では、子葉の次に発生する2枚のロゼット業をNo.1, 2とし、以降の葉は発生の順に番号(leafnumber、以後leaf No. とする)をつけ、それぞれの葉における防御応答を詳しく調べた。植物では本葉、特にNo.7以降の葉での防御機構はよく調べられているが、それ以前の葉(No. 1-6)の防御機構は調べられていない。Leaf No. ごとに抵抗性が異なっているのではないかと考えた。　そこで本研究では、過敏感反応を起こさないPst DC3000(vector) および過敏感反応を起こすPst DC3000(avrRpml)接種によって誘導されるシロイヌナズナの防御応答を調べ、ERボディが存在するGFPh植物体と存在しないnail変異株を比較することで、ERボディおよびPYK10と植物の生体防御機構の関連を明らかにすることを目的とした。ERボディおよびPYK10が蓄積しないnail、pyk10変異体にPstDC3000(avrRpm1)を接種した。接種後3日目の菌数を測定した結果、GFPh植物体と比較してnail変異体では菌数が顕著に増加していた。Pst DC3000(avrRpm1)は接種によって過敏感反応を引き起こすので、この生菌数の差と細胞死の関連を、細胞死の指標となるイオン漏洩伝導率の経時変化および感染12時間後のトリパンブルー染色を行い調べた。PstDC3000(avrRpm1)接種後のGFPh植物体とnail変異株では、すべてのleaf No.においてイオン漏洩伝導率およびトリパンブルー染色に差がみられなかった。これらの結果よりPYK10は過敏感細胞死に直接関係ないことが明らかになった。　また、PstDC3000(avrRpm1)接種後の第7葉をもちいて、ERボディの内容物であるPYK10の発現を定量PCRを用いて調べたところ、未接種と比較して約80倍に発現が上昇していた。 以上の結果からPYK10が細胞死に非依存的な抵抗性に関与していることが示唆された。　本研究では、傷害誘導および菌感染の手法を用いた解析より、ERボディは植物の生体防御に深く関わっていることが示唆された

Hexose Oxidase-Mediated Hydrogen Peroxide as a Mechanism for the Antibacterial Activity in the Red Seaweed Ptilophora subcostata

Marine algae have unique defense strategies against microbial infection.However, their mechanisms of immunity remain to be elucidated and little is known about the similarity of the immune systems of marine algae and terrestrial higher plants. Here, we suggest a possible mechanism underlying algal immunity, which involves hexose oxidase (HOX)-dependent production of hydrogen peroxide (H2O2). We examined crude extracts from five different red algal species for their ability to prevent bacterial growth.The extract from one of these algae, Ptilophora subcostata, was particularly active and prevented the growth of gram-positive and -negative bacteria, which was completely inhibited by treatment with catalase. The extract did not affect the growth of either a yeast or a filamentous fungus. We partially purified from P. subcostata an enzyme involved in its antibacterial activity, which shared 50% homology with the HOX of red seaweed Chondrus crispus. In-gel carbohydrate oxidase assays revealed that P. subcostata extract had the ability to produce H2O2 in a hexose-dependent manner and this activity was highest in the presence of galactose. In addition, Bacillus subtilis growth was strongly suppressed near P. subcostata algal fronds on GYP agar plates. These results suggest that HOX plays a role in P. subcostata resistance to bacterial attack by mediating H2O2 production in the marine environment

Thermal sensitivity of the antibacterial activity of the <i>P</i>. <i>subcostata</i> extract.

<p>The extract was incubated for 10 min at the indicated temperatures and subjected to an agar well diffusion assay. Relative antibacterial activity was calculated with activity from samples treated at 30°C as 100%. Representative data from three independent experiments with similar results are shown.</p

Antibacterial activity of extracts from five red algae.

<p>The algal extracts were applied to GYP agar plates onto which <i>B</i>. <i>subtilis</i> spores had been spread and their antibacterial activities were estimated by measuring the diameter of the clear inhibition zones after 16 h of incubation at 37°C. (A) Agar well diffusion assay showing inhibition of <i>B</i>. <i>subtilis</i> growth by <i>P</i>. <i>subcostata</i> extract. Upper, treated with kanamycin sulfate solution as a control. Lower, treated with <i>P</i>. <i>subcostata</i> extract. Growth-inhibition zones were observed. (B) Antibacterial activity of five red algae. *Diameter of growth-inhibition zone: -, 0 mm; +, ~7 mm; ++, 7–10 mm; +++, ≥10 mm.</p

Suppression of <i>B</i>. <i>subtilis</i> growth near <i>P</i>. <i>subcostata</i>.

<p>Algal fronds of <i>P</i>. <i>subcostata</i> were placed on a GYP agar plate onto which <i>B</i>. <i>subtilis</i> spores had been spread, then incubated at 37°C for 18 h. Bacterial colony formation was strongly suppressed near <i>P</i>. <i>subcostata</i> algal fronds.</p

Partial purification of antibacterial component(s) from <i>P</i>. <i>subcostata</i>.

<p>Partial purification of antibacterial component(s) from <i>P</i>. <i>subcostata</i>.</p

Antibacterial spectrum of <i>P</i>. <i>subcostata</i> extract against bacterial strains, yeast and filamentous fungus.

<p>Antibacterial spectrum of <i>P</i>. <i>subcostata</i> extract against bacterial strains, yeast and filamentous fungus.</p