RanGAP1*SUMO1 is phosphorylated at the onset of mitosis and remains associated with RanBP2 upon NPC disassembly

The RanGTPase activating protein RanGAP1 has essential functions in both nucleocytoplasmic transport and mitosis. In interphase, a significant fraction of vertebrate SUMO1-modified RanGAP1 forms a stable complex with the nucleoporin RanBP2/Nup358 at nuclear pore complexes. RanBP2 not only acts in the RanGTPase cycle but also is a SUMO1 E3 ligase. Here, we show that RanGAP1 is phosphorylated on residues T409, S428, and S442. Phosphorylation occurs before nuclear envelope breakdown and is maintained throughout mitosis. Nocodazole arrest leads to quantitative phosphorylation. The M-phase kinase cyclin B/Cdk1 phosphorylates RanGAP1 efficiently in vitro, and T409 phosphorylation correlates with nuclear accumulation of cyclin B1 in vivo. We find that phosphorylated RanGAP1 remains associated with RanBP2/Nup358 and the SUMO E2–conjugating enzyme Ubc9 in mitosis, hence mitotic phosphorylation may have functional consequences for the RanGTPase cycle and/or for RanBP2-dependent sumoylation

Studying the function of RanGAP1

Das RanGTPase-aktivierende Protein RanGAP1 ist ein essentieller Bestandteil des RanGTPase-Zyklus. Dieser wird für den aktiven Transport von Makromolekülen zwischen Kern und umgebendem Zytoplasma genutzt und ermöglicht darüber hinaus wichtige Funktionen bei mitotischen Prozessen. Ein signifikanter Teil von RanGAP1 ist posttranslational mit SUMO1 modifiziert und dies führt zu einer stabilen Assoziation mit dem Protein RanBP2. Dadurch wird RanGAP1 in Interphase zum Bestandteil der Kernporenkomplexe, während in Mitose ein kleiner Teil von RanGAP1 mit RanBP2 als Komplex an Kinetochoren und der Spindel auftaucht. Untersuchungen zur Funktion des RanGAP1 Proteins standen im Mittelpunkt dieser Arbeit. Zunächst sollte ein putativer Bindepartner von RanGAP1, das Protein Eferin, näher charakterisiert werden. Eferin war zuvor in einer yeast two hybrid Studie als Bindepartner identifiziert worden. In der vorliegenden Arbeit konnte Eferin als Bindepartner von RanGAP1 in Säugerzellen bestätigt und darüber hinaus erstmals auch als SUMO1-Bindeprotein beschrieben werden. Die weitere Charakterisierung zeigte, dass sich die Lokalisation von Eferin im Verlauf des Zellzyklus von den recyclisierenden Endosomen zu den Centrosomen und schließlich zur Teilungsfurche verlagert, während Eferin in Meta- und Anaphase abgebaut wird. Schließlich führte die Beobachtung einer in vitro Phosphorylierung von Eferin mit mitotischen Extrakten zur Identifizierung von Aurora-A als eine in vitro Kinase für Eferin. Aufgrund dieser Ergebnisse wird vorgeschlagen, dass Phosphorylierung Abbau und / oder Lokalisation von Eferin regulieren könnte.Ein zweites Projekt betraf die Regulation von RanGAP1 durch zellzyklusabhängige Phosphorylierung. In Zusammenarbeit mit Dr. Swaminathan konnte gezeigt werden, dass Phosphorylierung von RanGAP1 in Mitose weder die Stabilität des RanBP2-RanGAP1*SUMO1-Ubc9-Komplexes noch die aktivierenden Eigenschaften von RanGAP1 direkt beeinflusst. Die Ergebnisse dieses Projektes flossen in die Veröffentlichung Swaminathan, Kiendl et al. (2004) J Cell Biol ein.Beyond its main function in nucleocytoplasmic transport the RanGTPase cycle has been implicated in the regulation of various aspects of mitotic progression. The RanGTPase activating protein RanGAP1 is an essential component of the RanGTPase cycle. A significant portion of RanGAP1 is posttranslationally modified with SUMO1, leading to a stable association with RanBP2. As a consequence, RanGAP1 localizes to the nuclear pore complex in interphase while in mitosis a minor portion of RanGAP1 emerges in complex with RanBP2 at kinetochores and the mitotic spindle. The main issue of this study was to further elucidate the functions of RanGAP1.In a previously performed yeast two hybrid screen Eferin was identified as a putative RanGAP1 interacting protein. In this work, Eferin was confirmed as a binding partner of RanGAP1 in mammalian cells and described as a new SUMO1 binding protein in vitro. The further characterization showed that during the cell cycle, Eferin relocalizes from recycling endosomes to the centrosomes in prophase where Eferin is degraded in meta- and anaphase before it reappears at the cleavage furrow in telophase. Finally, observation of an in vitro phosphorylation of Eferin with mitotic extracts lead to the identification of Aurora A as an in vitro kinase for Eferin. Hence it is proposed that phosphorylation influences degradation and / or localization of Eferin.A second line of experiments addressed the regulation of RanGAP1 by cell cycle-dependent phosphorylation. In collaboration with Dr. Swaminathan it was shown that phosphorylation neither alters stability of the RanBP2-RanGAP1*SUMO1-Ubc9 complex nor affects activating properties of RanGAP1 in mitosis directly. These results were published in Swaminathan, Kiendl et al. (2004) J Cell Biol