Komplexität der Transkriptionsregulation durch PPARβ/δ

Der „peroxisome proliferator activated receptor β/δ“ (PPARβ/δ) ist ein Liganden-induzierbarer Transkriptionsfaktor, der neben einer essentiellen Rolle im Lipidmetabolismus und der Energiehomöostase auch Funktionen bei der Regulation der Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose besitzt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnten anhand von Expressionsanalysen und ChIP-Sequenzierung drei Klassen von Zielgenen in humanen Myofibroblasten identifiziert werden. Gene der ersten Klasse werden durch PPARβ/δ reprimiert und durch Agonisten schnell und stark aktiviert. Die zweite Klasse von Genen zeigt keine Repression durch PPARβ/δ. Die Induktion erfolgt durch Agonisten deutlich schwächer und langsamer und die Expression wird stark durch Antagonisten reprimiert. Die dritte Klasse enthält Gene, deren Expression direkt mit dem PPARβ/δ-Niveau korreliert, wobei die Regulation liganden-unabhängig ist. Desweiteren erfolgt die Bindung von PPARβ/δ im Gegensatz zur Klasse I und II ohne nachweisbare „PPAR response elements“ (PPREs). Zusammenfassend erlauben diese Daten somit die Definition unterschiedlicher Klassen von PPARβ/δ-Zielgenen, die sich in den Mechanismen ihrer Regulation unterscheiden. PPARβ/δ spielt nicht nur eine Schlüsselrolle in der Regulation metabolischer Signalwege sondern moduliert zudem inflammatorische Prozesse und besitzt eine essentielle Funktion im Tumorstroma, was auf eine funktionelle Interaktion von PPARβ/δ und Zytokin-Signalwegen hinweist. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mittels genomweiter Expressionsanalyse gezeigt werden, dass PPARβ/δ- und „transforming growth factor β“ (TGFβ)-Signalwege in humanen Myofibroblasten funktionell miteinander agieren. Eine Anzahl von Genen werden kooperativ durch TGFβ und PPARβ/δ aktiviert. Für das Modellgen „angiopoeitin-like 4“ (ANGPTL4) konnten zwei Enhancer Regionen identifiziert werden, die für die synergistische Aktivierung verantwortlich sind. Ein TGFβ-induzierbarer, stromaufwärts vom Transkriptionsstart (TS) gelegener Enhancer (ca. -8,5 kb relativ zum TS) wird durch einen Mechanismus reguliert, der SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 Transkriptionsfaktoren einbezieht, welche mit mehreren benachbarten Bindestellen interagieren. Ein zweiter Enhancer (PPAR-E), der aus drei nebeneinander liegenden PPREs besteht, befindet sich im Intron 3 des ANGPTL4-Gens (ca. +3,5 kb relativ zum TS). Der PPAR-E wird durch alle drei PPAR-Subtypen stark aktiviert, wobei ein neuartiges PPRE Motiv eine zentrale Rolle einnimmt. Obwohl der PPAR-E nicht durch TGFβ reguliert wird, interagiert diese Region mit SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 in vivo, was eine mögliche mechanistische Erklärung für den beobachteten Synergismus liefert

Reverse crosstalk of TGFβ and PPARβ/δ signaling identified by transcriptional profiling

Previous work has provided strong evidence for a role of peroxisome proliferator-activated receptor β/δ (PPARβ/δ) and transforming growth factor-β (TGFβ) in inflammation and tumor stroma function, raising the possibility that both signaling pathways are interconnected. We have addressed this hypothesis by microarray analyses of human diploid fibroblasts induced to myofibroblastic differentiation, which revealed a substantial, mostly reverse crosstalk of both pathways and identified distinct classes of genes. A major class encompasses classical PPAR target genes, including ANGPTL4, CPT1A, ADRP and PDK4. These genes are repressed by TGFβ, which is counteracted by PPARβ/δ activation. This is mediated, at least in part, by the TGFβ-induced recruitment of the corepressor SMRT to PPAR response elements, and its release by PPARβ/δ ligands, indicating that TGFβ and PPARβ/δ signals are integrated by chromatin-associated complexes. A second class represents TGFβ-induced genes that are downregulated by PPARβ/δ agonists, exemplified by CD274 and IL6, which is consistent with the anti-inflammatory properties of PPARβ/δ ligands. Finally, cooperative regulation by both ligands was observed for a minor group of genes, including several regulators of cell proliferation. These observations indicate that PPARβ/δ is able to influence the expression of distinct sets of both TGFβ-repressed and TGFβ-activated genes in both directions

Genomewide Analyses Define Different Modes of Transcriptional Regulation by Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-β/δ (PPARβ/δ)

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear receptors with essential functions in lipid, glucose and energy homeostasis, cell differentiation, inflammation and metabolic disorders, and represent important drug targets. PPARs heterodimerize with retinoid X receptors (RXRs) and can form transcriptional activator or repressor complexes at specific DNA elements (PPREs). It is believed that the decision between repression and activation is generally governed by a ligand-mediated switch. We have performed genomewide analyses of agonist-treated and PPARβ/δ-depleted human myofibroblasts to test this hypothesis and to identify global principles of PPARβ/δ-mediated gene regulation. Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) of PPARβ/δ, H3K4me3 and RNA polymerase II enrichment sites combined with transcriptional profiling enabled the definition of 112 bona fide PPARβ/δ target genes showing either of three distinct types of transcriptional response: (I) ligand-independent repression by PPARβ/δ; (II) ligand-induced activation and/or derepression by PPARβ/δ; and (III) ligand-independent activation by PPARβ/δ. These data identify PPRE-mediated repression as a major mechanism of transcriptional regulation by PPARβ/δ, but, unexpectedly, also show that only a subset of repressed genes are activated by a ligand-mediated switch. Our results also suggest that the type of transcriptional response by a given target gene is connected to the structure of its associated PPRE(s) and the biological function of its encoded protein. These observations have important implications for understanding the regulatory PPAR network and PPARβ/δ ligand-based drugs

Komplexität der Transkriptionsregulation durch PPARβ/δ

Der „peroxisome proliferator activated receptor β/δ“ (PPARβ/δ) ist ein Liganden-induzierbarer Transkriptionsfaktor, der neben einer essentiellen Rolle im Lipidmetabolismus und der Energiehomöostase auch Funktionen bei der Regulation der Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose besitzt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnten anhand von Expressionsanalysen und ChIP-Sequenzierung drei Klassen von Zielgenen in humanen Myofibroblasten identifiziert werden. Gene der ersten Klasse werden durch PPARβ/δ reprimiert und durch Agonisten schnell und stark aktiviert. Die zweite Klasse von Genen zeigt keine Repression durch PPARβ/δ. Die Induktion erfolgt durch Agonisten deutlich schwächer und langsamer und die Expression wird stark durch Antagonisten reprimiert. Die dritte Klasse enthält Gene, deren Expression direkt mit dem PPARβ/δ-Niveau korreliert, wobei die Regulation liganden-unabhängig ist. Desweiteren erfolgt die Bindung von PPARβ/δ im Gegensatz zur Klasse I und II ohne nachweisbare „PPAR response elements“ (PPREs). Zusammenfassend erlauben diese Daten somit die Definition unterschiedlicher Klassen von PPARβ/δ-Zielgenen, die sich in den Mechanismen ihrer Regulation unterscheiden. PPARβ/δ spielt nicht nur eine Schlüsselrolle in der Regulation metabolischer Signalwege sondern moduliert zudem inflammatorische Prozesse und besitzt eine essentielle Funktion im Tumorstroma, was auf eine funktionelle Interaktion von PPARβ/δ und Zytokin-Signalwegen hinweist. Im zweiten Teil der Arbeit konnte mittels genomweiter Expressionsanalyse gezeigt werden, dass PPARβ/δ- und „transforming growth factor β“ (TGFβ)-Signalwege in humanen Myofibroblasten funktionell miteinander agieren. Eine Anzahl von Genen werden kooperativ durch TGFβ und PPARβ/δ aktiviert. Für das Modellgen „angiopoeitin-like 4“ (ANGPTL4) konnten zwei Enhancer Regionen identifiziert werden, die für die synergistische Aktivierung verantwortlich sind. Ein TGFβ-induzierbarer, stromaufwärts vom Transkriptionsstart (TS) gelegener Enhancer (ca. -8,5 kb relativ zum TS) wird durch einen Mechanismus reguliert, der SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 Transkriptionsfaktoren einbezieht, welche mit mehreren benachbarten Bindestellen interagieren. Ein zweiter Enhancer (PPAR-E), der aus drei nebeneinander liegenden PPREs besteht, befindet sich im Intron 3 des ANGPTL4-Gens (ca. +3,5 kb relativ zum TS). Der PPAR-E wird durch alle drei PPAR-Subtypen stark aktiviert, wobei ein neuartiges PPRE Motiv eine zentrale Rolle einnimmt. Obwohl der PPAR-E nicht durch TGFβ reguliert wird, interagiert diese Region mit SMAD3, ETS1, RUNX2 und AP-1 in vivo, was eine mögliche mechanistische Erklärung für den beobachteten Synergismus liefert

Regulation of TAK1/TAB1-Mediated IL-1β Signaling by Cytoplasmic PPARβ/δ

<div><p>The peroxisome proliferator-activated receptor subtypes PPARα, PPARβ/δ, PPARγ are members of the steroid hormone receptor superfamily with well-established functions in transcriptional regulation. Here, we describe an unexpected cytoplasmic function of PPARβ/δ. Silencing of PPARβ/δ expression interferes with the expression of a large subset of interleukin-1β (IL-1β)-induced target genes in HeLa cells, which is preceded by an inhibition of the IL-1β-induced phosphorylation of TAK1 and its downstream effectors, including the NFκBα inhibitor IκBα (NFKBIA) and the NFκBα subunit p65 (RELA). PPARβ/δ enhances the interaction between TAK1 and the small heat-shock protein HSP27, a known positive modulator of TAK1-mediated IL-1β signaling. Consistent with these findings, PPARβ/δ physically interacts with both the endogenous cytoplasmic TAK1/TAB1 complex and HSP27, and PPARβ/δ overexpression increases the TAK1-induced transcriptional activity of NFκB. These observations suggest that PPARβ/δ plays a role in the assembly of a cytoplasmic multi-protein complex containing TAK1, TAB1, HSP27 and PPARβ/δ, and thereby participates in the NFκB response to IL-1β.</p></div

Effect of PPARβ/δ depletion on global transcriptional response to IL-1β.

<p>(<b>A</b>) Diagrammatic representation of IL-1β target genes (threshold ≥2-fold; <i>n</i> = 113) showing a reduced induction by IL-1β (threshold ≥1.8-fold; <i>n</i> = 55) or no significant effect on induction (threshold ≤1.4-fold; <i>n</i> = 32) after PPARβ/δ depletion. HeLa cells were treated with control siRNA <i>(</i>si-con) or <i>PPARD</i>-directed siRNA (si-PPARD) followed by IL-1β (10 ng/ml) for 1 h (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011.s001" target="_blank">Figure S1</a> for knockdown efficiency). Expression patterns were determined by microarray analyses and genes showing a ≥2-fold regulation were identified (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011.s015" target="_blank">Datasets S1</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011.s016" target="_blank">S2</a>). The observed regulation was verified by RT-qPCR, as exemplified for the genes listed in the boxed areas and shown in <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011.s002" target="_blank">Figures S2</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011.s003" target="_blank">S3</a>. (<b>B</b>) Scatter plot showing the IL-1β response of individual genes with or without <i>PPARD</i> silencing (microarray data from panel A). The dashed line shows the ideal position of genes theoretically unaffected by si-PPARD. Blue data points: effect ≤1.4-fold; red data points: effect ≥1.8-fold. (<b>C</b>), (<b>D</b>) Effect of PPARβ/δ depletion on the time course of the IL-1β-mediated induction of the <i>IL6</i> (C) and <i>IL8</i> (D) gene determined by RT-qPCR. (<b>E</b>) Effect of PPARβ/δ depletion on IL-1β-induced IL-6 secretion in HeLa cells determined by ELISA (1 h and 4 h stimulation with IL-1β). Values represent averages ±SD (<i>n</i> = 3). ***, **, *significant difference between si-con and si-PPARD-treated cells (<i>p</i><0.001, <i>p</i><0.01, <i>p</i><0.05 by t-test).</p

Modulation of p65 binding to NFκB target genes <i>in vivo</i> by PPARβ/δ.

<p>HeLa cells were treated with IL-1β and siRNAs as indicated and ChIP assays were performed with antibodies against PPARβ/δ (green), RXR (white) or p65 (red) or control IgG (grey). PCR primers were designed to detect the NFκB binding sites of the <i>IL6</i> (<b>A</b>), <i>IL8</i> (<b>B</b>), <i>BCL3</i> (<b>C</b>) and <i>CXCL10</i> (<b>D</b>) genes, the triple-PPRE of the ANGPTL4 gene (<b>E</b>) or an irrelevant genomic control region (<b>F</b>). Relative amounts of amplified DNA in immunoprecipitates were calculated by comparison with 1% of input DNA. Results are expressed as % input and represent averages of triplicates (± S.D). ***, **, *significant differences between si-con and si-PPARD-treated cells (<i>p</i><0.001, <i>p</i><0.01, <i>p</i><0.05 by t-test).</p

Interaction of endogenous PPARβ/δ with HSP27, TAK1 and TAB1.

<p>Untransfected HEK293T cells were treated with formaldehyde to stabilize protein interactions following the protocol for ChIP analyses. Cell extracts were prepared and immuneprecipitations were carried out with either irrelevant IgG or with antibodies against PPARβ/δ. RXR, HSP27, TAK1 or TAB1 (IP). Immunoblotting was performed with PPARβ/δ-specific antibodies. Antibodies against the established PPAR heterodimerization partner RXR were included as a positive control. The PPARβ/δ-HSP27 co-immunoprecipitation was abolished after pretreatment of the cell with HSP27 siRNA, confirming its specificity (not shown). The two rightmost lanes represent untreated extracts from HCT116 cells with intact (+/+) or disrupted (−/−) <i>PPARD</i> alleles <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0063011#pone.0063011-Park2" target="_blank">[34]</a> to allow for unambiguous identification of the PPARβ/δ band. *, non-specific band.</p