Paracrine and cell-cell interactions of adipose-derived stem cells and mammary epithelial cells focusing on breast cancer development after cell-assisted lipotransfer

Objectives: Adipose-derived stem cells (ADSC) have become an innovative tool for stem cell therapy, especially in tissue engineering, with an advanced clinical application in cell-assisted lipotransfer (CAL) to the breast. However, CAL has also raised questions and concerns regarding the use of stem cells in such a sensitive and complex microenvironment as the mammary tissue. With this intention, the following investigation was designed to elucidate the cell biological interactions between ADSC and normal mammary epithelial cells (NORMA MEC). Attending to concerns about possible breast cancer relapse and even de novo breast cancer development in particular, the influence of ADSC on breast tissue remodeling and patient-dependent behavior of NORMA MEC was analyzed within this study. Design and Methods: In the present in vitro experimental project, primary human NORMA MEC and ADSC were selectively isolated from 5 healthy female patients after mammary reductoplasty. The isolated cells were characterized by immunofluorescence staining, multilineage differentiation and gene expression analysis. The paracrine and cell-cell interactions of ADSC and NORMA MEC were evaluated with the help of functional cell assays, ADSC secretome culture models, direct and indirect co-culture models, immunofluorescence staining as well as molecular biological analysis via real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Observation and Results: The present investigation demonstrated the stimulation of NORMA MEC viability, proliferation, migration, transmigration as well as invasion potential by ADSC and their secretome. Direct co-culture with ADSC supported NORMA MEC Ki67 expression as well as colony formation and ADSC integrated into the clustering NORMA MEC network. During indirect co-culture with ADSC, we observed traces of NORMA MEC performing cell fusion phenomena. Furthermore, genetic analysis of NORMA MEC revealed an elevated expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, matrix metalloproteinases (MMP), epithelial cell markers and extracellular matrix (ECM) receptors provoked by ADSC and their secretome. Conclusion: This in vitro experimental study elucidates the stimulating effect of ADSC and their secretome on NORMA MEC. Additionally, we observed patient-dependency among the cellular response patterns. The achieved results indicate the support of breast tissue remodeling and transplant integration by ADSC. Nevertheless, the promoting in vitro potential of ADSC via paracrine influences and cell-cell interactions might contain the unrecognized power of fueling malignant processes in the context of premalignant lesions or residual breast cancer cells.Hintergrund und Ziele: Stammzellen aus dem weißen Fettgewebe haben das Gebiet der Gewebszüchtung deutlich innoviert und wurden in den letzten Jahren zunehmend in zellbasierte Therapieverfahren integriert. Gerade die Technik der zellassistierten Eigenfetttransplantation hat sich in der Plastischen, Ästhetischen und Rekonstruktiven Chirurgie der Brust verstärkt etabliert und an Popularität gewonnen, zumal die Anreicherung mit Fettstammzellen ein verbessertes Langzeitergebnis durch eine optimale Regenerationsfähigkeit verspricht. Dennoch bringen die große Beliebtheit bei Chirurgen und Patienten sowie die hohe Anwendungsrate viele berechtigte Fragen und Bedenken mit sich. Gerade die onkologische Sicherheit von Stammzelltherapie an solch einem sensiblen und komplexen Gewebe wie der Brustdrüse wird kritisch diskutiert. Dabei zeigen bereits aktuelle experimentelle Daten, dass Parallelen zwischen Gewebsregeneration und Tumorförderung durch Fettstammzellen existieren. Aspekte wie Gefäßneubildung, Durchblutungsförderung, Proliferationssteigerung sowie Migrations- und Invasionsbereitschaft der Brustepithelzellen stehen im Mittelpunkt der gegenwärtigen Forschung. Diese zellulären Vorgänge sind zwar essenziell für eine suffiziente Gewebsregeneration, können allerdings auch bei malignen Prozessen zur Tumorentwicklung und Metastasierung führen. Vor diesem Hintergrund wurde das vorliegende in-vitro experimentelle Forschungsprojekt entwickelt, um die parakrinen und interzellularen Einflüsse von Fettstammzellen und ihren Botenstoffen auf Brustepithelzellen zu untersuchen. Im Zusammenhang mit der zellassistierten Eigenfetttransplantation bietet diese Studie zudem neue Erkenntnisse über den Einfluss von Fettstammzellen auf das Regenerationspotential von Brustgewebe. Dabei wird auch auf patienten-abhängige Faktoren der zellassistierten Eigenfetttransplantation eingegangen. Des Weiteren werden erste Ansätze zur Beurteilung möglicher tumorfördernder Fähigkeiten der Fettstammzellen im Rahmen einer zellassistierten Eigenfetttransplantation verfolgt. Methoden: Als neuartige Grundlage für die vorliegende Studie wurden Brustepithelzellen sowie Fettstammzellen aus humanem Brustdrüsengewebe von 5 gesunden Patientinnen, die sich elektiven Mammareduktionsplastiken unterzogen, isoliert. Anhand der Immunzytochemie, des multipotenten Differenzierungsverhaltens sowie der Genexpression wurden die selektiv isolierten Zellen charakterisiert. Anschließend wurden parakrine und interzellulare Interaktionen von Fettstammzellen und Brustepithelzellen unter Zuhilfenahme von funktionellen Zellkulturversuchen, Kulturmodellen im konditionierten Medium der Fettstammzellen, direkten und indirekten Co-Kultursystemen, immunzytochemischen Färbungen sowie molekularbiologischen Untersuchungen mittels Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (engl. real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR) analysiert und bewertet. Ergebnisse und Beobachtungen: Die in-vitro Untersuchungen zeigten, dass Fettstammzellen und ihre Botenstoffe zu einer Stimulation der Viabilität, Proliferation, Migration, Transmigration sowie Invasion von Brustepithelzellen beitragen. Im direkten Co-Kultursystem stimulierten Fettstammzellen die nukleäre Expression des Proliferationsmarkers Ki67 in Brustepithelzellen und integrierten sich in die entstandenen Brustepithelzellkolonien. In indirekter Co-Kultur mit Fettstammzellen gingen Brustepithelzellen zudem potenzielle Zellfusionen ein. Genexpressionsanalysen der Brustepithelzellen wiesen des Weiteren auf, dass unter dem Einfluss von Fettstammzellen und ihrer Botenstoffe die Expression von Genen der Epithelial-Mesenchymale Transition, Matrixmetalloproteinasen, epithelialen Genen sowie extrazellulären Matrixrezeptoren ansteigt. Schlussfolgerungen und Diskussion: Die vorliegende Studie demonstriert, wie Fettstammzellen und ihre Botenstoffe eine stimulierende Wirkung auf Brustepithelzellen haben. Bezogen auf den Zustand nach einer zellassistierten Eigenfetttransplantation, kann demnach die Anreicherung mit Fettstammzellen Umbau- und Regenerationsvorgänge im Brustgewebe positiv fördern und zur Integration des Transplantats beitragen. Allerdings ist die Stimulation der Brustepithelzellen durch Fettstammzellen im Hinblick auf die onkologische Sicherheit weiterhin kritisch zu bewerten. Hierbei lassen sowohl parakrine Zellkommunikation als auch direkte und indirekte Zellinteraktionen bei Vorgängen wie einer malignen Zellveränderung Zweifel aufkommen, da das Regenerationspotential der Fettstammzellen auch malignen Prozessen dienen kann. Die Bewertung und Aufklärung in Bezug auf das individuelle Brustkrebsrisiko ist daher dringend erforderlich, um die Eignung des Patienten für solch eine Behandlung sorgfältig evaluieren zu können. Die zellassistierte Eigenfetttransplantation sollte zudem Hochrisikopatienten sowie Brustkrebspatienten mit fortgeschrittenem Erkrankungsstadium oder hohem Rezidivrisiko zunächst nicht empfohlen werden. Weitere experimentelle in-vitro und in-vivo Untersuchungen sowie randomisierte klinische Fall-Kontroll-Studien sind zwingend notwendig, um den bisherigen Wissensstand auf diesem Gebiet weiter auszubauen und auch aus onkologischer Perspektive eine sichere Anwendung am Patienten gewährleisten zu können

Selective isolation and characterization of primary cells from normal breast and tumors reveal plasticity of adipose derived stem cells

Background There is a need to establish more cell lines from breast tumors in contrast to immortalized cell lines from metastatic effusions in order to represent the primary tumor and not principally metastatic biology of breast cancer. This investigation describes the simultaneous isolation, characterization, growth and function of primary mammary epithelial cells (MEC), mesenchymal cells (MES) and adipose derived stem cells (ADSC) from four normal breasts, one inflammatory and one triple-negative ductal breast tumors. Methods A total of 17 cell lines were established and gene expression was analyzed for MEC and MES (n = 42) and ADSC (n = 48) and MUC1, pan-KRT, CD90 and GATA-3 by immunofluorescence. DNA fingerprinting to track cell line identity was performed between original primary tissues and isolates. Functional studies included ADSC differentiation, tumor MES and MEC invasion co-cultured with ADSC-conditioned media (CM) and MES adhesion and growth on 3D-printed scaffolds. Results Comparative analysis showed higher gene expression of EPCAM, CD49f, CDH1 and KRTs for normal MEC lines; MES lines e.g. Vimentin, CD10, ACTA2 and MMP9; and ADSC lines e.g. CD105, CD90, CDH2 and CDH11. Compared to the mean of all four normal breast cell lines, both breast tumor cell lines demonstrated significantly lower ADSC marker gene expression, but higher expression of mesenchymal and invasion gene markers like SNAI1 and MMP2. When compared with four normal ADSC differentiated lineages, both tumor ADSC showed impaired osteogenic and chondrogenic but enhanced adipogenic differentiation and endothelial-like structures, possibly due to high PDGFRB and CD34. Addressing a functional role for overproduction of adipocytes, we initiated 3D-invasion studies including different cell types from the same patient. CM from ADSC differentiating into adipocytes induced tumor MEC 3D-invasion via EMT and amoeboid phenotypes. Normal MES breast cells adhered and proliferated on 3D-printed scaffolds containing 20 fibers, but not on 2.5D-printed scaffolds with single fiber layers, important for tissue engineering. Conclusion Expression analyses confirmed successful simultaneous cell isolations of three different phenotypes from normal and tumor primary breast tissues. Our cell culture studies support that breast-tumor environment differentially regulates tumor ADSC plasticity as well as cell invasion and demonstrates applications for regenerative medicine

Plasticity of patient-matched normal mammary epithelial cells is dependent on autologous adipose-derived stem cells

Due to the increasing clinical application of adipose-derived stem cells (ADSC), e.g. lipotransfer for breast reconstruction, this study aimed to gain novel insights regarding ADSC influence on breast tissue remodeling and determine patient-dependent factors affecting lipotransfer as well as begin to address its oncological risks. The ADSC secretome was analyzed from five normal breast reduction patients and contained elevated levels of growth factors, cytokines and proteins mediating invasion. ADSC/ADSC secretomes were tested for their influence on the function of primary mammary epithelial cells, and tumor epithelial cells using cell culture assays. ADSC/ADSC secretomes significantly stimulated proliferation, transmigration and 3D-invasion of primary normal and tumor epithelial cells. IL-6 significantly induced an EMT and invasion. The ADSC secretome significantly upregulated normal epithelial cell gene expression including MMPs and ECM receptors. Our study supports that ADSC and its secretome promote favorable conditions for normal breast tissue remodeling by changing the microenvironment. and may also be important regarding residual breast cancer cells following surgery

Haemolysis and other biochemical evaluations of vacuum-assisted venous drainage in cardiac surgery

Haemolysis and other biochemical evaluations of vacuum-assisted venous drainage in cardiac surgery Aims of the study: Vacuum-assisted venous drainage (VAVD) improves the quality of venous return in procedures using extracorporeal circulation systems (ECC). Nevertheless, there is not an evidence that such high negative pressure applied to ECC in combination with selective bicaval cannulation due to open heart surgery cause a trauma to blood elements and deteriorates organ function. A prospective randomised study was designed to demonstrate that negative pressure of -20 mm Hg to -80 mm Hg does not cause a significant haemolysis and organ deterioration in such procedures. Materials and methods: 85 consecutive patients undergoing combined cardiac surgery procedure with two separate venous cannulas were randomised in three groups A, B and C. VAVD with negative pressure of -20 to -45 mm Hg was applied to 28 patients in group A and negative pressure of -45 mm Hg to -80 mmHg was applied to 28 patients in group B. There was zero negative pressure applied to 29 patients in group C. Six blood samples were taken from each patient and examinated for haemolysis and other indicators of organ deterioration such as hemoblobin, platelet count, free hemoglobin, aptoglobin, lactate-dehydrogenase, aspartate-amino-transferase,..