Transthyretin amiloid fibrillumok nanobiofizikai vizsgálata = Nanobiophysical exploration of transthyretin amyloid fibrils

Kísérleteinkben AFM segítségével vizsgáltuk transthyretin (TTR) amiloid fibrillumok amiloidogén fibrillum képződési mechanizmusait. Protofibrillumokon végzett egyedi molekula erőspektroszkópiai mérések eredményeit a natív TTR szerkezeti paramétereivel hasonlítottuk össze annak érdekében, hogy szerkezeti és dinamikai bepillantást nyerjünk a fibrillumok belső elrendezésébe és az összetartó erők természetébe. Időfüggő AFM felvételek segítségével a protofibrillum képződést követő belső szerkezeti változásokat térképeztük fel. Eredményeink szerint a protofibrillum képződés első lépése amorf aggregátumok kialakulása, amelyek idővel gyűrű alakú szerkezetekké állnak össze. Hasonló gyűrű alakú intermediéreket más amiloid fibrillumok esetében is megfigyeltek. A gyűrűk egymáshoz rendeződve tubuláris strukturákat alakítanak ki, amely a protofibrillum kialakulásának további alapját képezi. Az oldat kicserélésére a struktura szétesik, szétzippzározódási lépéseken keresztül. A nanomechanikai mérések arra utalnak, hogy a TTR egységek ß-szálak mentén tekerednek szét, továbbá érett protofibrillumokban az intermonomerikus kapcsolatok megerősödnek. Megfigyeléseink alapján a TTR fibrillogenezis egy szerkezeti modelljét állítottuk fel. | In this work we used AFM to follow the amyloidogenetic pathway of transthyretin (TTR) by imaging the events leading to the formation of amyloid protofilaments. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) of protofilaments was compared to naive TTR in order to probe dynamic and structural differences. We observed that the pathway proceeds through the formation of transient amorphous aggregates, followed by the occurrence of annular oligomers (rings or doughnuts). In other types of amyloidoses similar ring structures have been implicated in cytoxicity, but their properties and involvement in the amyloid pathway are poorly understood. We show that the rings have a tendency to stack, forming tubular protofilaments. These tubular protofilaments precede the appearance of amyloid protofilaments. Their height and pitch resemble those of previous structural models for the TTR amyloid protofilament. Upon solvent exchange we also observed amyloid protofilament dissociation. The dissociation appears to proceed through an unzipping mechanism, revealing structures reminiscent of the TTR annular oligomers. SMFS of protofilaments revealed a time-dependent increase in the length of the manipulated structure, suggesting that associations between monomers stabilize with time. Force spectra of native TTR and protofilaments contained transitions spaced 4 nm apart, indicating that the component ß-strands unfold sequentially. Based on our results a model of TTR protofilament assembly is proposed

Global Alteration of Colonic MicroRNAome Landscape associated with Inflammatory Bowel Disease

Inflammatory Bowel Disease (IBD) is characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract that associates with, among others, increased risk of colorectal cancer. There is a growing evidence that miRNAs have important roles in pathological processes, such as inflammation or carcinogenesis. Understanding the molecular mechanisms such as alterations in microRNAome upon chronic intestinal inflammation is critical for understanding the exact pathomechanism of IBD. Hence, we conducted a genome wide microRNAome analysis by applying miRNA-Seq in a rat model of experimental colitis, validated the data by QPCR, examined the expression of a selection of precursor and mature miRNAs, performed in depth biological interpretation using Ingenuity Pathway Analysis and tested the obtained results on samples derived from human patients. We identified specific, interdependent expression pattern of activator/repressor transcription factors, miRNAs and their direct targets in the inflamed colon samples. Particularly, decreased expression of the miR-200 family members (miR-200a/b/c,-141, and -429) and miR-27b correlates with the reduced level of their enhancers (HNF1B, E2F1), elevated expression of their repressors (ZEB2, NFKB1) and increased expression of their target genes (ZEB2, RUNX1). Moreover, the marked upregulation of six miR-27b target genes (IFI16, GCA, CYP1B1, RUNX1, MEF2C and MMP13) in the inflamed colon tissues is a possible direct consequence of the lack of repression due to the downregulated miRNA-27b expression. Our data indicate that changes in microRNAome are associated with the pathophysiology of IBD, consequently, microRNAs offer potential targets for the diagnosis, prognosis and treatment of IBD

Dispersion and stabilization of cochleate nanoparticles

Cochleates, calcium-stabilized membrane rolls of nanoscale diameter, promise a unique and efficient way of delivering lipid-soluble drugs, proteins or nucleic acids into biological systems because they protect the encapsulated material against enzymatic or chemical degradation. Self-aggregation, which typically arises during production and storage is a major obstacle that has so far precluded the development of an efficient cochleate-based drug-delivery system. Here we show that citric acid, added transiently in a narrow concentration range, effectively disperses cochleate aggregates, stabilizes the disperse state for long-term storage and preserves the canonical ultrastructure and topological characteristics of cochleate nanoparticles

Nkx2-3-A Slippery Slope From Development Through Inflammation Toward Hematopoietic Malignancies

The development of peripheral lymphoid tissues from the mesoderm is the result of a complex convergence combining lymphohematopoietic differentiation with the local specification of nonhematopoietic mesenchymal components. Although the various transcriptional regulators with fate-determining effects in diversifying the mobile leukocyte subsets have been thoroughly studied and identified, the tissue-specific determinants promoting the regional differentiation of resident mesenchyme are less understood. Of these factors, various members of the NK-class Nkx paralogues have emerged as key regulators for the organogenesis of spleen and mucosal lymphoid tissues, and recent data have also indicated their involvement in various pathological events, including gut inflammation and hematopoietic malignancies. Here, we summarize available data on the roles of Nkx2-3 in lymphoid tissue development and discuss its possible value as a developmental marker and disease-associated pathogenic trait.The author(s) disclosed receipt of the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: Z.K. is supported by the ÚNKP-17-4-I New National Excellence Program of the Ministry of Human Capacities and the postdoctoral research grant of the Faculty of Medicine, University of Pécs. This work was supported by OTKA K108429, GINOP-232-15-2016-00050, and EFOP-361-16-2016- 00004 research funds.S

Az új típusú koronavírus nanobiofizikája = Nanobiophysics of new type coronavirus

A Covid-19-pandémia végigsöpört az egész világon, soha nem látott megterhelést okozva egészségügyi rendszereinkben, és kihívások elé állította a biomedicinális kutatást, hogy a járványra mielőbb megfelelő válaszokat adjunk. A modern „egy partikulum” biofizikai módszerek különleges bepillantást engednek a járvány okozója, a SARSCoV- 2 tulajdonságaiba. A vírus tüske fehérjékből álló koronaszerű réteget hordoz a felületén, melyeknek fontos szerepet tulajdonítunk a fertőzés folyamatában. Atomi erőmikroszkóp segítségével sikerült feltárnunk a natív virionok topográfiai szerkezetét és mechanikai tulajdonságait. A tüskefehérjék, rugalmasságuk és mozgékonyságuk révén, dinamikus felületet alkotnak. A virionok meglepően ellenállóak a mechanikai összenyomással szemben, és szerkezetük képes helyreállni a mechanikai behatást követően. A vírus globális szerkezete ellenáll a hőhatásnak, de a hőmérséklet fokozásával a tüskefehérjék disszociálódnak a felületről. A SARS-CoV-2 mechanikai és dinamikai sajátosságai hozzájárulnak fertőző képességéhez. Az alkalmazott „egy partikulum” biofizikai módszerek fontos szerepet játszhatnak az egyre gyakoribbá váló vírusfertőzések megértésében és legyőzésében. = The Covid-19 pandemic has swept across the world, causing a never seen burden on our health care systems and challenging biomedical research to give appropriate answers to the epidemic. Modern, one-particle biophysical methods ensure special insight to the characteristics of the cause of the epidemic, the SARS-CoV-2. The virus carries a crown-like layer of spike proteins, which plays a fundamental role in the process of infection. The topography structure and mechanical characteristics of native virions have been determined by atomic force microscopy. Spike proteins form a dynamic surface due to their flexibility and motility. Virions are surprisingly resistant to mechanical compression, and their structure is able to recover after mechanical perturbation. The global structure of the virus is resistant to heat effect, but spike proteins dissociate from the surface with higher temperatures. The mechanical and dynamic characteristics of SARS-CoV-2 contribute to its virulence. The applied one-particle biophysical methods play an important role in understanding and fighting with the more common virus infections

Citoszkeletális izomfehérjék molekuláris mechanikája nanobiotechnológiai módszerekkel = Molecular mechanics of cytoskeletal muscle proteins using nanobiotechnological methods

Pályázatunkban elsősorban a titin óriás izomfehérje, annak rekombináns fragmentumai és egyéb izom-citoszkeletális fehérjék nanobiotechnológiai vizsgálatával foglalkoztunk. Egyedi titinmolekulák és rekombináns titin fragmentumok molekuláris mechanikai tulajdonságait és a miozin motorfehérjék in vitro motilitási sajátosságait tanulmányoztuk. Egyedi molekulák mechanikai manipulálására kifejlesztett erőmérő lézercsipesz berendezésünket továbbfejlesztettük, és fluoreszcens technikákkal kombináltuk. Ugyancsak egyedi molekulák mechanikai manipulálására alkalmas atomerőmikroszkópos berendezést helyeztünk üzembe. Atomerőmikroszkópos (AFM) berendezésünket és módszereinket továbbfejlesztettük, mellyel lehetővé vált egyedi fehérjék célzott, in situ mechanikai manipulálása. Az AFM módszert sikerrel kombináltuk teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópiával (TIRFM), mellyel lehetővé vált sejtek és molekulák egyidejű topográfiai és fluoreszcenciás vizsgálata. Eredeti megfigyeléseket tettünk a titin lokális rugalmasságának és mecahnikai stabilitásának, aktinnal való kölcsönhatásainak és a dezmin intermedier filamentumok nanomechanikai viselkedésének megismerésében. | Our project primarily addressed the nanobiotechnology of the giant muscle protein titin, the recombinant fragments of titin, and other filamentous proteins of the muscle cytoskeleton. We examined the molecular mechanics of individual molecules of titin and its recombinant fragments and the motile characteristics of myosin motor proteins with novel methodologies. Our force-measuring optical tweezers instrument was developed further and was combined with fluorescence imaging. We have installed an atomic force microscope system capable of mechanical manipulation of single biomolecules. We have developed our AFM system and analysis further so that it enables us to carry out in situ force spectroscopic measurements. Our AFM was combined with total internal reflection fluorescence microscopy that enables us to follow the surface topography and mechanics of the sample together with its fluorescence properties, in a spatially and temporally synchronized fashion. We have made and published original observations about the local and global nanomechanical behavior of titin, its interactions with actin filaments, and the elasticity and force-driven transitions of the muscle-specific desmin intermediate filaments

Amyloid ß-fibrillumok nanomechanikája = Nanomechanics of amyloid ß-fibrils

Pályázatban amiloid béta (Aß) fibrillumokat, és ehhez kapcsolódóan hasonló természetű amiloid fibrillumokat és egyéb fibrilláris biomolekuláris rendszereket vizsgáltunk. A kísérletekben atomerőmikroszkóp segítségével vizsgáltuk a fibrillumok topográfiai szerkezetét és mechanikai erővezérelt szerkezeti átalakulásait. Különböző amiloid fibrillumok nanomechanikai ujjlenyomatát mértük meg. Felfedeztük, hogy az Aß peptid egy fragmentuma, az Aß25-35, trigonálisan orientált hálózatot hoz létre csillám felszínen. Ez nanotechnológiai alkalmazások lehetőségét veti fel, amellyel kapcsolatban szabadalmi bejelentést indítottunk el. Új mérési technológiákat fejesztettünk ki: térben és időben szinkronizált TIRF/AFM, illetve pásztázó próba kimográfia. A nanomechanikai módszereinket sikerrel adaptáltuk intermedier filamentumokra és miozin vastag filamentumokra. | In this grant proposal we have investigated te properties of amyloid beta (Aß) fibrils and other relevant amyoids and fibrillar biomolecular systems. In our experiments the topographical structure and mechanical force-driven structural changes of the fibrils were explored by using atomic force microscopy(AFM). We measured the nanomechanical fingerprint of various amyloid fibrils. We discovered that a toxic fragment of the full-length Aßpeptide, Aß25-35, forms a trigonally oriented network on mice. The phenomenon opens the possiblity towards nanotechnological applications. Based on this we filed a preliminary patent application (US 61/058,244). We developed novel methodologies: spatially and temporally resolved TIRF/AFM, scanning force kymography. Our nanomechanical methods were implemented on yet unexplored biomolecular systems: intermediate filaments and myosin thick filaments

Citoszkeletális fehérjék szerkezete, dinamikája, mechanikája és kölcsönhatásai: egyedi molekuláktól szupramolekuláris rendszerekig = Structure, dynamics, mechanics and interactions of cytoskeletal proteins: from single molecules to supramolecular systems

Pályázatunkban a citoszkeletális fehérjék szerkezetét, dinamikáját, mechanikáját és kölcsönhatásait vizsgáltuk elsősorban a harántcsíkolt izom különböző molekuláris rendszerein. Szintetikus miozin vastag filamentumok szerkezetét és nanomechanikáját atomerőmikroszkóppal (AFM) mértük. A titin Z-lemez horgonyzó komplex mechanikai stabilitását erőspektroszkópiával vizsgáltuk. Natív vázizom titin rugalmasságának és erővezérelt szerkezetváltozásainak vizsgálatára erővisszacsatolt lézercsipeszt fejlesztettünk. A titin PEVK domén konformációs dinamikáját FRET spektroszkópiával vizsgáltuk. A dezmin intermedier filamentumok és protofibrillumok szerkezetét és nanomechanikáját ugyancsak AFM-mel mértük meg. A szívizom típusú miozin-kötő C-fehérje molekuláris mechanikáját Monte-Carlo módszerrel szimuláltuk. Az aktomiozin motilitás pontosabb térbeli változásainak mérésére fluoreszcencia interferencia kontraszt (FLIC) mikroszkópia fejlesztését kezdtük meg. Az izommechanika organizmusban való mérésére speciális, AFM-alapú módszert dolgoztunk ki C. elegans rendszeren. A pályázat közvetlen támogatásával nyolc eredeti közlemény és egy könyvfejezet került publikálásra. | In our project we investigated the structure, dynamics, mechanics and interactions of cytoskeletal proteins mainly on muscle-derived molecular systems. The structure and nanomechanics of myosin thick filaments were explored by using atomic force microscopy (AFM). The mechanical stability of the Z-disc titin-anchoring complex was measured with single-molecule force spectroscopy. In order to measure the elasticity and force-driven structural changes in native titin molecules with high resolution, we developed a fast force-clamp optical tweezers apparatus. The structural dynamics of titin PEVK domain fragments was measured by using FRET spectroscopy. The structure and nanomechanical behavior of desmin intermediate filaments and protofibrils were also measured with AFM. For the simulation of the force versus extension of cardiac myosin-binding protein-C we used Monte-Carlo methods. To reveal greater spatial detail in the in vitro actomyosin motility we began developing a fluorescence interference contrast (FLIC) microscope system. In order to investigate the actomyosin mechanics within an organism, we developed a novel, AFM-based detection method based on C. elegans. With the direct support of the grant eight original papers and one book chapter were published

Alterations in the properties of the cell membrane due to glycosphingolipid accumulation in a model of Gaucher disease

K

Differential Effects of the Absence of Nkx2-3 and MAdCAM-1 on the Distribution of Intestinal Type 3 Innate Lymphoid Cells and Postnatal SILT Formation in Mice

Seeding of leukocytes to developing lymphoid tissues in embryonic and early postnatal age and to the mucosa throughout adulthood depends on the interaction between endothelial MAdCAM-1 addressin and its cognate ligand α4β7 integrin. Nkx2-3 as a transcriptional regulator of MAdCAM-1 controls vascular patterning in visceral lymphoid tissues in mice, and has been identified as a susceptibility factor for inflammatory bowel diseases in humans, associated with lymphoid neogenesis in the inflamed intestines. The role of Nkx2-3 in the organogenesis of the solitary intestinal lymphoid tissues (SILTs) involving type 3 innate lymphoid cells (ILC3) is still unknown. Here we investigated the effect of Nkx2-3 on the postnatal distribution of intestinal ILC3s and the development of SILTs, comparing these to mice lacking MAdCAM-1, but preserving Nkx2-3. At 1 week of age small intestines (SI) contained significantly higher number of ILC3s relative to the colon, with a substantial reduction in MAdCAM-1−/− mice compared to C57BL/6 controls. One week later SI ILC3 number decreased in all genotypes, the number of colonic ILC3 of both Nkx2-3-deficient and Nkx2-3-heterozygous mice significantly increased. On the fourth postnatal week a further reduction of SI ILC3s was observed in both Nkx2-3-deficient and Nkx2-3-heterozygous mice, while in the colon the number of ILC3s showed a significant reduction in all genotypes. At 1 week of age only sporadic SILT components were present in all genotypes. By the second week mice deficient for either Nkx2-3 or MAdCAM-1 showed absence of SILT maturation compared to their relevant controls, lacking mature isolated lymphoid follicles (ILF). By the fourth week both Nkx2-3-deficient and Nkx2-3-heterozygous mice showed a similar distribution of ILFs relative to cryptopatches (CP), whereas in MAdCAM-1−/− mice CPs and immature ILFs were present, mature ILFs were scarce. Our data demonstrate that the complete absence of MAdCAM-1 partially impairs intestinal seeding of ILC3s and causes partial blockade of SILT maturation, without affecting peripheral lymph node development. In contrast, the inactivation of Nkx2-3 permits postnatal seeding, and its blocking effect on SILT maturation prevails at later stage, thus other adhesion molecules may compensate for the intestinal homing of ILC3s in the absence of MAdCAM-1